心肌肌钙蛋白i超敏检测试剂盒及超敏检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化物质的检测领域，具体涉及一种心肌肌钙蛋白I超敏检测试剂盒 及其制备方法，还涉及一种心肌肌钙蛋白I超敏检测方法。
【背景技术】
[0002] 肌钙蛋白是横纹肌收缩的调节蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由三种亚基组成，分 别为TnI、TnC和TnT。三种亚基形成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要调节作用。 TnI为肌动蛋白的抑制亚基，有三种亚型：快骨骼肌亚型（fTnl)、慢骨骼肌亚型（sTnl)和心 肌亚型（心肌肌钙蛋白I，cTnl)。其中心cTnl分子质量23. 9kD，包含有210个氨基酸残 基。cTnl含量升高可作为诊断急性心肌梗死（AMI)的重要血清学指标。发生急性心肌梗塞 时，cTnl由于心肌受到障碍在4-8小时内被释放到血液中，因此其浓度脱离健康人的浓度 范围。通常，AMI发病后12-18小时后，cTnl浓度达到最高，并且维持5-10日。
[0003] 急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有 剧烈而持久的胸骨后疼痛，靠休息以及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性 增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，甚至危及生命，是心内科的 常见疾病之一，严重危害人类健康。此病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗 死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发病人数至少50万，现患至少200万。近年来AMI 在治疗上取得很大发展，从消极的保守治疗转为积极的消除血栓或经皮冠状动脉扩张术乃 至进行冠状动脉搭桥术治疗。这就对早期准确诊断出AMI提出了很高的要求，但AMI发作 时敏感性只有50 %左右，随着时间的延长，敏感性逐步提高，至6h敏感性可达90 %以上，表 现出随着时间推移敏感性逐渐升高的趋势，意味着早期准确诊断出AMI的关键问题是提高 检测方法的灵敏度。
[0004] 目前,AMI的检测方法主要有特征性心电图衍变以及血清生物标志物的动态变化。 但是，约有25%的心肌梗死患者发病早期没有典型的临床症状，约50%左右的AMI患者缺 乏心电图的特异改变，若单独依靠心电图改变和临床症状，AMI的诊断符合率仅为75%。在 这种情况下，心肌损伤标志物的检测在诊断AMI时尤为重要。心肌损伤标志物主要为肌酸 激酶同工酶（CK-MB)及cTnl。其中，由于cTnl具有心肌损伤后动态释放迅速、曲线完整、峰 值明显、组织特异性强、窗口诊断期长、测定方法快、血中出现早等优点，基于cTnl对AMI的 诊断方式优于基于CK-MB对AMI的诊断方式，因此已被临床广泛接受。cTnl不仅成为诊断 急性心肌梗死的"金标准"，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察、危险分级及预后评估 的最合适标志物。
[0005] cTnl的测定方法很多，主要有放射性同位素免疫分析法（RIA)、酶联免疫吸附试 验法（ELISA)、以及胶体金免疫层析法（ICA)等。近年来，随着对cTnl研究的发展，一些新 的更加准确的检测方法在临床检验科中得以开展，如化学发光法（CLIA)。
[0006] 放射性同位素免疫分析法法因其存在着操作繁琐、检测时间长、不适合大批量检 测、结果重复性差、核素污染等问题，已基本不使用。
[0007] 酶联免疫吸附试验法的测定原理是以包被固相载体的特异性抗体为第一抗体，加 入待测血清后，再加入生物素标记的第二抗体，形成双夹心，孵育后冲洗分离，加入发光基 质底物，测得的光强度与标准曲线相比可得cTnl的浓度值。然而，酶联免疫吸附试验法存 在着操作繁琐、测定周期偏长、灵敏度相对较低、线型范围偏窄等诸多不足；尤其是，由于 cTnl血清含量偏低，采用ELISA法检测cTnL表现出明显的灵敏度较差的问题，使临床无法 在早期快速准确的诊断出AMI发作，因而限制了 ELISA法在cTnl临床检测方面的进一步应 用。
[0008] 胶体金免疫层析法标本用量少，简便快速，适合于cTnl的床旁检测。其基本原理 均是利用两个抗cTnl单克隆抗体的结合来检测cTnl，当血清样本滴到吸收孔内，第一个被 胶体金标记的抗体与cTnl结合形成一个抗体抗原复合物，第二个固定化的cTnl单抗捕捉 到这个结合体，产生一个粉色的条带，对于无结合体的存在，反应圈内则没有色带。但胶体 金免疫层析法仅能进行定性测定，对于定量测定则灵敏度很差。基于胶体金免疫层析法开 发的检测卡，虽然可快速完成cTnl定性检测，但同样由于灵敏度较低的问题，在AMI早期， 血清中仅含有少量cTnl的情况下，胶体金免疫层析法无法准确诊断出AMI的发作，所以在 临床应用上还是有很大的局限性。
[0009] 化学发光法是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或 抗体的标记免疫分析技术，包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光 分析系统是利用化学发光物质，经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间 体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量 光量子产额。免疫反应系统是将标记物质直接标记在抗原或抗体上，经过特异性反应后形 成抗原-抗体复合物，然后进行相应标记物的检测方法检测。CLIA的主要优点是灵敏度高、 线性范围宽、标记物的有效期长、无放射性危害、可实现全自动化等。
[0010] Siemens公司提供的CTnI检测试剂盒包含RcadyPackli主试剂包，含ADVIA Cental^超敏Tnl?二元标记试剂、固相试剂和辅助试剂。二元标记试剂包括吖啶酯标记 的山羊多克隆抗cTnl抗体（~0. 15yg/mL)，2个生物素标记的鼠单克隆抗cTnl抗体（~ 2.0 μ g/mL);固相试剂为乳胶磁性颗粒悬浮液；辅助试剂为非磁性乳胶颗粒。该公司的 ADVIA Centaur超敏TnI检测法是采用直接化学发光技术的3位点夹心免疫测试法。在检 测过程中，二元标记试剂中的抗体与样品中的肌钙蛋白I结合，产生免疫复合物。免疫复合 物中所含的生物素随机与磁性颗粒上标记的链霉亲和素结合。
[0011] Roche公司提供的cTnl检测试剂盒，可将其中的生物素化的抗cTnl的单克隆抗体 和钌（Ru)络合物标记的抗cTnl单克隆抗体与抗原形成三明治夹心法结构，通过电化学发 光免疫分析法（ECLIA)测定cTnl。
[0012] 化学发光法虽具有准确、特异性强、精密度好的优点，其灵敏度也远高于酶联免疫 吸附试验法和胶体金免疫层析法。但是，现有的CTnI商业检测试剂盒灵敏度对于临床应用 依然不够高，分析灵敏度都在5pg/mL以上，因而不能够准确地检测超低浓度的cTnl，故不 能满足AMI早期诊断的高要求。
【发明内容】
[0013] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种CTnI检测试剂盒及其制备方 法，该试剂盒具有超高灵敏度，可以为AMI的早期诊断提供准确的检测结果，从而提高AMI 早期诊断的敏感性。
[0014] 本发明还提供一种CTnI检测方法，具有超高灵敏度，为AMI的早期诊断提供了更 为先进的方法。
[0015] 根据本发明，提供了一种CTnI检测试剂盒，所述试剂盒包括标记有示踪标记物的 至少一株第一抗cTnl抗体和包被磁性微球的至少一株第二抗cTnl抗体，并且所述第一抗 cTnl抗体与cTnl的结合位点相异于第二抗cTnl抗体与cTnl的结合位点。所述第一抗 cTnl抗体和第二抗cTnl抗体可以是抗cTnl单克隆抗体和/或抗cTnl多克隆抗体。该试 剂盒是超敏检测试剂盒，在用于检测cTnl时，具有很高的灵敏度。
[0016] 在本发明中，所述第一抗CTnI抗体和第二抗CTnI抗体的区别在于它们与CTnI的 位点结合不同。因此，在本发明的等同技术方案中，试剂盒也可以包括标记有示踪标记物的 至少一株第二抗cTnl抗体和包被磁性微球的至少一株第一抗cTnl抗体。就本发明而言， 超敏是指检测灵敏度在5pg/mL以下，尤其是3pg/mL以下。
[0017] 本发明采用双抗体夹心法检测cTnl，这种方法采用两株或多株针对cTnl的单克 隆或多克隆抗体，其中被标记的一株或多株抗cTnl的单抗或多抗用于捕获cTnl氨基酸区 段，连接在载体上的其他株抗cTnl的单抗或多抗用于结合cTnl上不同于前者所结合的氨 基酸区段。
[0018] 优选地，所述第一抗cTnl抗体与cTnl的结合位点为cTnl的10-100氨基酸区段； 所述第二抗cTnl抗体与cTnl的结合位点为cTnl的40-200氨基酸区段。选择这些结合区 段的cTnl抗体有利于对其进行更好地标记或包被磁球，同时有利于在检测过程中cTnl抗 体与cTnl的结合，提高检测特异性、准确性。
[0019] 在一个优选实施方案中，所述试剂盒包括两种第一抗cTnl抗体，与cTnl的结合位 点分别为cTnl的10-50和60-100氨基酸区段；所述试剂盒包括两种第二抗cTnl抗体，与 cTnl的结合位点分别为cTnl的40-80和120-200氨基酸区段。
[0020] 根据本发明，所述示踪标记物可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标 记物，例如金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶， 尤其优选为N- (4-氨丁基）-N-乙基异鲁米诺（ABEI)。
[0021] 适用于本发明的磁性微球也称为磁珠，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的 是，本发明使用的磁性微球，是将纳米级的Fe 2O3或Fe 304磁性粒子和有机高分子材料进行复 合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用 下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特 别限制，可根据需要进行选择。
[0022] 本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0. 1_5μπι，磁性微球还可以通过表面改 性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-C00H、-ΝΗ2。
[0023] 在一个具体实施例中，所述磁性微球为Fe2O3或Fe 304磁性纳米粒子与有机高分子 材料的复合体，并具有〇. 1-5 μ m的粒径；并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有 一种或多种活性功能基团。
[0024] 根据本发明，在所述试剂盒中，第一抗cTnl抗体和第二抗cTnl抗体的浓度分别为 1- 20μ g/mL，示踪标记物的浓度为5-500ng/mL，磁性微球的浓度为0. l-2mg/mL。上述各成 分的浓度基于包含该成分的各试剂盒组分的量计。
[0025] 根据本发明，所述示踪标记物直接或间接地标记第一抗cTnl抗体。间接标记的方 式包括但不限于通过异硫氰酸荧光素（FITC)与抗FITC抗体体系或通过链霉亲和素（SA) 与生物素（Biotin)体系进行间接标记。直接标记是指ABEI直接与第一抗cTnl抗体连接 进行标记；间接标记是指通过中间媒介链接体系使得ABEI标记第一抗cTnl抗体，所述中间 媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。本发明 人发现，间接标记有利于减弱空间效应，有利于信号的放大，使得检测更加灵敏。
[0026] 根据本发明，所述第二抗cTnl抗体直接或间接地包