心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及心肌肌钙蛋白I均相酶免疫法测定试剂盒。本发明是应用作用于人心 肌肌钙蛋白I(CTnI)单肽链特定位点的抗体，及采用该抗体制备测定血清中心肌肌钙蛋白 I(cTnl)含量的均相酶联免疫试剂的方法。该发明制备的试剂盒可用于半自动或全自动生 发分析仪器，属于医学生物学领域。
【背景技术】
[0002] 心肌肌钙蛋白I(CTnI)是心肌损伤敏感及特异性最强的标志物之一，在急性心 肌损伤及心肌炎中作为判断心肌细胞损伤的金标准，也作为冠动脉综合征危险分层及预 后的关键生化标志物。肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，由肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋 白I(Tnl)、肌钙蛋白C(TnC)三条肽段组成，其中肌钙蛋白I(cTnl)属于一种碱性蛋白， 共210个氨基酸，在血清中游离形式只占4. 1 %，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合在 一起，以复合体形式存在（Ward DG, Cornes MP, Trayer IP. Structural consequences of cardiac troponin I phosphorylation. J Biol Chem, 2002, 277 (44): 41795·)，此外还有可 能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式释放（Ward DG, Ashton PR, Trayer HR, et al. Additional PKA phosphorylation sites in human cardiac troponin I. Eur J Biochem, 2001，268 (I) : 179.)，属于心肌损伤高敏感指标性物质，在"微型心肌损伤"中肌钙 蛋白I即可出现阳性结果，因此是临床上作为心肌细胞损伤的标志性生化检测项目之一。
[0003] 由于肌钙蛋白I(CTnI)在血清中存在的形式多样，而且衰减周期短，因此 对识别肌钙蛋白I(cTnl)的抗体有很高要求，且不同方法制备的抗体在测定肌钙蛋 白I(cTnl)含量时，所得结果也完全不同，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnl)含量测 定无法标准化(KatrukhaA, BereznikovaA, Filatov V, et al. Biochemical factos influencing measurement ofcardiac troponin I in serum.Clin ChemLab Med, 1999, 37(11/12) :1091.)。
[0004] 临床上对肌钙蛋白I (CTnI)的检测灵敏度及特异性要求很高，虽然测定肌钙蛋白 I(cTnl)的方法很多，但是定量测定受到许多因素的影响，从而导致各种检测结果之间相差 很大。其中最主要原因是在患者血清中肌钙蛋白I(cTnl)会有不同程度的降解、游离、复合 物形式及不同的清除率，形成肌钙蛋白I(cTnl)在血清中的不同半衰期，因此各种检测方 法中分别使用针对上述不同抗原决定簇的抗体，其免疫反应必然有很大差异。
[0005] 目前关于比浊测定法测定肌钙蛋白I(CTnI)的试剂有很多厂家，但是不管是试剂 灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求，这是因为肌钙蛋白I(cTnl)在正常人血清 中含量极低，在〇. 〇8ng/ml以下，而大多比浊法检测极限在lng/ml，而且在此检测极限情况 下，影响测定结果的因素也被成倍放大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是设计一组cTnl的微型肽段，将该组微型肽段分别标记于载体酶 上(Friguet B, Djavadi-Ohaniance L, Pages J, Bussard A, Goldberg M. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site.Application to hybridomas specific for the beta 2-subunit ofEscherichia coli tryptophan synthase. J Tmmunol Methods, 1983Jun 10:60(3) :351-8.)，与作用于该组肽段抗体共同组成一个测定样本cTnl 的检测试剂，该试剂可用于半自动或全自动生化分析仪器准确、特异性的测定血清中心肌 肌钙蛋白I(cTnl)含量。
[0007] 本发明的技术方案
[0008] 1. -种肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括：根 据肌钙蛋白I全氨基酸序列合成相应抗体作用位点10-30个氨基酸的微型肽段，将合成肽 段共价标记于载体（酶蛋白）并制备反应试剂；同时采用肽段作用的抗体制备成免疫酶试 剂和纯化人心肌肌1丐蛋白I (cTnl)制备而成的标准品。
[0009] 2.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒 中的免疫酶试剂是按以下方法制备的：
[0010] ⑴据肌钙蛋白I(cTnl)氨基酸序列，分别选取氨基端（序列2)，羧基端（序列4) 和中心区（序列3)氨基酸序列，获得其相应肽段（序列5或8, 7或10和6或9)，一般氨基 残基数在5-30个，采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
[0011] (2)选用酶蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体共价偶联；并将上 述肽段混合后与载体进行标记，或分别与载体进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离 纯化，获得标记量均一的肽段-酶标记物；
[0012] (3)分别将上述作用位点的cTnl多克隆抗体与酶相应底物制备成免疫反应试剂。
[0013] 3.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒 中
[0014] 免疫酶试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、酶底物10g/L、cTnl多克隆抗体lg/L加 纯水至1000ml ;
[0015] 反应试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、cTnl肽段-酶标记物0. lg/L加纯水至 1000 rnl ；
[0016] 标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I (cTnl) 5ng/ml、pH = 5. 8的PBS缓冲液。
【具体实施方式】
[0017] 本发明是采用人工合成获得所需人心肌肌钙蛋白I(cTnl)的三条肽段，将获得的 肽段分别与载体（酶蛋白）制备成肽段-酶标记物。同时利用三条肽段作为配体，聚丙烯 酰胺为配基制备的亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该 肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体其优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相 应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。
[0018] 将上述方法筛选获得的抗体、酶底物和缓冲液制备成试剂1 (免疫酶试剂）；将肽 段-酶标记物和缓冲液制备成试剂2 (反应试剂）。
[0019] 具体操作步骤如下：
[0020] 1.肌钙蛋白I (cTnl)不同肽段抗体的制备：
[0021] (1)按常规方法（D.R.马歇克J.T.门永R.R.布格斯等著，朱厚础译.蛋白质纯化 与鉴定实验指南.科技出版社，2000版。）提取自人血清中的肌钙蛋白I(cTnl)肽链，并进 行氨基酸序列测序，所得氨基酸序列（序列1):
[0022] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro He Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln He Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp He GLU Ala Lys Val Thr Lys Asn lie Thr Glu He Ala Asp Leu Thr Gln Lys He Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg He Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn He Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0023] (2)利用蛋白水解酶定点水解肌钙蛋白I(cTnl)肽链，采用凝胶排阻色谱法和反 相高效液相色谱法进行肽段分布测定和纯化，收集需要的肽段。
[0024] 1)氨基端肽段：长度为70个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端1~70残基之内 (序列2)
[0025] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro I Ie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys I Ie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln I Ie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly
[0026] 2)中心区肽段：长度为82个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端34~116残基之 内（序列3):
[0027] His Ala Lys Lys Lys Ser Lys I Ie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln I Ie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp I Ie Glu
[0028] 3)羧基端肽段：长度为101个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端110~210残基 之内（序列4):
[0029] Glu Arg Tyr Asp I Ie Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn I Ie Thr Glu He Ala Asp Leu Thr Gln Lys I Ie Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg I Ie Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn I Ie Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0030] 上述水解用蛋白酶可以蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，无花果蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋 白酶，菠萝蛋白酶，羧肽酶Y。水解时间为〇. 5~4小时，本发明优选蛋白酶K和羧肽酶Y， 水解时间为1小时。
[0031] (3)用牛血清白蛋白分别将以上氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段进行修饰， 与弗氏佐剂混合对兔进行免疫，也可选用山羊，本发明优选兔。
[0032] 上述选用的肽段修饰载体也可选用鸡卵清蛋白，兔血清白蛋白，纤维蛋白原，优选 牛血清白蛋白。
[0033] (4)获取兔抗人肌钙蛋白I(cTnl)各肽段的高效价混合免疫血清，采用高效液相 色谱分离纯化获得各区段目标多肽为配体，聚丙烯酰胺为配基的亲和层析柱，将多克隆抗 体血清进行亲和层析
[0034] 获得的具有高亲和力和特异性的抗体，分别编号：
[0035] 识别氨基端肽段的抗体为：cTnl-Ab-l
[0036] 识别中心区肽段的抗体为：cTnI-Ab-2
[0037] 识别羧基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-3。
[0038] 2.该试剂盒cTnl肽段-酶试剂是按以下方法制备的：
[0039] (1)肽段的合成
[0040] 根据肌钙蛋白I(CTnI)氨基酸序列，分别选取羧基端、氨基端和中心区氨 基酸序列，获得其相应肽段，一般氨基残基数在5~20个。采用多肽合成仪进行合 成（MACKIERK，SMITHDM. (editor)Guidebooktoorganic synthesis. CHEN SHAO，DING CHENYUAN，CEN RENWAN G(Translators) ,Beijing :Science Press，1988