基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物细菌标记技术领域，尤其涉及一种基于量子点间接荧光免疫细菌标记方法。
【背景技术】
[0002]由于工业的发展，环境污染越来也严重，空气中充满各种病原体，细菌，这些病原体细菌一旦被人呼吸或者其他方式感染很容易引发多种疾病，例如，在人体的呼吸道中经常会感染诸如病毒，细菌，支原体，衣原体，军团菌等微生物病菌，而引发支气管炎，慢性支气管炎，肺炎，支气管扩张等疾病。但是目前为了标记具体病菌的类别主要采用免疫蛋白标记方法，进行病菌的识别标记，但是这种标记识别方式稳定性差，存在寿命短，标记效率低。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其解决了目前病菌检测标记中稳定性差，标记效率低的技术问题。
[0004]为达到上述目的，本发明所提出的技术方案为:
[0005]本发明的一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其包括如下步骤:
[0006]第一步，对病原体进行包被，并进行增殖培养；
[0007]第二步，设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴极质控孔中，做阴极对照，将吸附有病毒的MDCK细胞包被在玻片阳极质控孔中，做阳极对照；
[0008]第三步，用化学交联法将量子点与抗人IgM的特异性抗体连接，得到量子点修饰抗体；
[0009]第四步，利用计算机对扫描图片进行镜检和分析。
[0010]其中，所述的第一步中病原体增殖培养，培养至病原体细胞长至80%单层。
[0011]其中，所述的玻片上设有凹槽，所述凹槽底部设有纵横分布的条纹。
[0012]其中，所述的病原体包被包括以下步骤:
[0013]第一步，用体积比5%的磷壁酸溶液处理玻片；
[0014]第二步，将病原体细胞悬浮液用超声波震荡10至20秒，然后将细胞悬浮液滴加在玻片孔中；
[0015]第三步，将细胞悬浮液用紫外线照射10至15分钟，然后用冷丙酮固定10分钟；
[0016]第四步，用体积比为50 %的甘油溶液浸润5分钟；
[0017]第五步，吹干后冷冻保存待用。
[0018]其中，所述的量子点包括单一化合物的量子点和核壳型量子点。
[0019]其中，所述的化学交联法为EDC/NHS交联法。
[0020]与现有技术相比，本发明的一种基于量子点间接免疫荧光标记方法，其灵敏度高、自动化强、细胞固定稳固等优点。
【附图说明】
[0021]图1为本发明一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法的流程图；
[0022]图2为本发明一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法的包被方法流程图。
【具体实施方式】
[0023]以下参考附图，对本发明予以进一步地详尽阐述。
[0024]请参阅图1和附图2，本发明的一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其包括如下步骤:
[0025]第一步SI，对病原体进行包被，并进行增殖培养；
[0026]第二步S2，设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴极质控孔中，做阴极对照，将吸附有病毒的MDCK细胞包被在玻片阳极质控孔中，做阳极对照；
[0027]第三步S3，用化学交联法将量子点与抗人IgM的特异性抗体连接，得到量子点修饰抗体；
[0028]第四步S4，利用计算机对扫描图片进行镜检和分析。
[0029]其中，所述的第一步中病原体增殖培养，培养至病原体细胞长至80%单层。
[0030]其中，所述的玻片上设有凹槽，所述凹槽底部设有纵横分布的条纹。
[0031]其中，请参阅附图2，所述的病原体包被包括以下步骤:
[0032]第一步Tl，用体积比5%的磷壁酸溶液处理玻片；
[0033]第二步T2，将病原体细胞悬浮液用超声波震荡10至20秒，然后将细胞悬浮液滴加在玻片孔中；
[0034]第三步T3，将细胞悬浮液用紫外线照射10至15分钟，然后用冷丙酮固定10分钟；
[0035]第四步T4，将体积比为50 %的甘油溶液浸润5分钟；
[0036]第五步T5，吹干后冷冻保存待用。
[0037]更具体的，所述步骤一 S1:对病原体进行包被，首先进行病原体的增殖培养。例:人流感病毒选用MDCK细胞，呼吸道合胞病毒选用HEP-2细胞等，对人流感病毒、呼吸道合胞病毒等病原体进行增殖。首先进行细胞株培养，待细胞长至80%单层，吸附病毒液，增殖病毒。待细胞出现病变，将病变细胞固定到玻片上。
[0038]以人流感病毒为例:从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37°C温水中，并不时摇动令其尽快融化。
[0039]从37°C水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心弃去上清液，加入含培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱静置培养。
[0040]75% -90%成片细胞准备，用40X物镜观察细胞生长状态，用Hank’s液清洗细胞3遍。将hank’s液吸出，并加入适量病毒液于细胞培养瓶中，温和摇动数次。放于37°C，5%C02培养箱吸附l_2h。
[0041]将病毒液吸出，用hank’s液清洗细胞2遍，然后加入病毒生长液于细胞培养瓶中，放于培养箱中培养，待80%细胞出现病变时，每瓶用0.0lM PH7.4PBS吹打制备细胞悬液，滴加到玻片孔内。紫外照射lOmin，冷丙酮固定lOmin，吹干后冷冻保存。
[0042]步骤二 S2:设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴性质控孔中，作阴性对照。将吸附甲型流感病毒的MDCK细胞包被在玻片阳性质控孔中，做阳性对照。
[0043]步骤三S3:用化学交联法将量子点与抗人IgM的特异性抗体连接，得到量子点修饰的抗体。所述量子点包括①单一化合物的量子点，包括:第III族和第V族化合物合成的量子点，包括GaSb，InAs, InP, InGaAs, InAlAs任意一种；第II族和第VI族组成的化合物，包括 MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe，CdTe任意一种；第1乂族和第IV族组成的化合物中的一种，包括SiC，SiGe中的任意一种；第IV族和第VI族组成的化合物中的一种核壳型量子点，包括ZnS包覆CdSe，ZnS包覆CdTe中的任意一种。
[0044]步骤四S4:利用计算机对扫描图片进行镜检和分析:首先扫描抗原片上行，对时间进行记录，逐个玻片孔进行扫描检测，每一孔用不同颜色标示。将上行图片扫描完毕，再次进行下行扫描，记录结果。电脑通过时间顺序将上下行的扫描顺序分开，以及颜色的区别来进行自动判读。
[0045]首先:选取不同的增殖材料对病原体进行增殖，并选用不同颜色选用(波长460、500、580、610、650nm)五种波长的量子点对二抗进行标记。
[0046]抗原片的制备:利用细胞或者培养基对病原体进行增殖，例如流感病毒用MDCK细胞、呼吸道合胞病毒用HEP-2细胞。
[0047]设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴性质控孔中，作阴性对照。将吸附甲型流感病毒的MDCK细胞包被在玻片阳性质控孔中，做阳性对照。
[0048]量子点与抗抗体的连接:选用(波长460、500、580、610、650nm)五种波长的量子点对二抗进行标记。
[0049]取8 μ mo I/ml 的 CdTe/ZnS 核壳型量子点 460、500、580、610 和 650 分别置于 10 μ I于EP管中，加入2ml浓度为lOmmol/L，pH = 7.2磷酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min, 25°C条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，使最后一次量子点总体积不超过50 μ I。用微量pH计检测最终pH并调节pH值至7.3。
[0050]取2mmol EDC和0.5mmol NHS迅速加入量子点溶液中，涡旋振荡器震荡均匀后置摇床上反应60min，反应温度为24°C。反应结束后加入2ml浓度为50mmol/L，pH = 8.5硼酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min，25°C条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，使最后一次量子点总体积不超过200 μ I。用微量pH计检测最终PH并调节pH值至8.5。取0.8 μ mo I的CRP抗体和PCT抗体分别置于不同EP管中，加入2ml浓度为50mmol/L，pH = 8.5硼