一种黄曲霉毒素b1的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种霉菌毒素残留的免疫化学快速检测技术，具体涉及一种黄曲霉毒 素 Bl的检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物，主要污染 玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉毒素以黄曲霉毒素 Bl为主，黄曲霉毒素 Bl是最强 的产生于自然界的致癌物质之一，主要是引起肝脏、肺和胸部的病变。鉴于黄曲霉毒素的毒 性，欧盟规定用于动物饲料或人类直接食用产品的黄曲霉毒素 Bl的最高残留限量为2ppb ; 我国规定食品中黄曲霉毒素 BI的最高残留限量为5ppb。
[0003] 现有的黄曲霉毒素 BI检测方法主要有理化方法、ELISA方法、胶体金层析法等。这 些方法各有优缺点，无法满足现场快速检测的需求。理化方法前处理过程复杂、仪器化程度 高、操作繁琐、效率低。ELISA方法经过多次洗脱过程，标记物酶易失活，底物见光易分解，环 境干扰因素复杂等缺点，且已不能满足越来越低的限量标准。胶体金层析法可以满足现场 快速的要求，但是其检测灵敏度低1，且只能定性检测无法得到定量结果。
[0004] 现有一些黄曲霉毒素 Bl定量检测试剂盒，如已公开专利CN103134924A-种检 测黄曲霉毒素 Bl的试剂盒、CN 103018458A超灵敏黄曲霉毒素 Bl酶联免疫检测试剂盒、 CN1673747A -种检测黄曲霉毒素 Bl的试剂盒及其检测方法，公开的试剂盒均采用是酶联 免疫或荧光标记免疫分析方法。酶联免疫或荧光标记免疫分析方法是采用固相吸附分离的 方法，需要固相材料吸附捕获抗体-待检抗原-标记抗体，由于标记抗体为过量，所以检测 前均需要洗涤去除未参加反应的标记抗体。此时，通过检测与待测抗原结合的标记抗体，才 能与待测抗原呈正比例关系。
[0005] 固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操 作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免 疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面：
[0006] 1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被于固相材料表面的抗体分子其 构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限 制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限 度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。
[0007] 2. "洗板"或"洗球"是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加 检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶 免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密 度，出现批间、批内差异。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素 Bl的检测试剂盒及检测方法，以解决现 有检测盒中试剂种类多，其检测方法操作繁琐，检测灵敏度低的问题。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种黄曲霉毒素 Bl的检测方法。
[0010] 为实现本发明的目的，采用以下技术方案。
[0011] 一种黄曲霉毒素 Bl的检测试剂盒，其包括如下试剂：受体微球、供体微球、生物素 化黄曲霉毒素 Bl、黄曲霉毒素 Bl标准品；
[0012] 其中，所述受体微球包被有黄曲霉毒素 Bl抗体，所述供体微球包被有链霉亲和 素。
[0013] 如上所述的黄曲霉毒素 Bl检测试剂盒，优选地，还包括70%甲醇溶液和NaCl。
[0014] 如上所述的黄曲霉毒素 Bl检测试剂盒，优选地，所述受体微球的浓度为IOyg/ mL~50 μ g/mL，所述供体微球的浓度为10 μ g/mL~50 μ g/mL，所述生物素化黄曲霉毒素 Bl 浓度为 1 μ g/mL ~10 μ g/mL。
[0015] 如上所述的黄曲霉毒素 BI检测试剂盒，优选地，所述受体微球的缓冲溶液为含有 0. 2% BSA，0.02% Proclin-300的PBS溶液，所述生物素化黄曲霉毒素 Bl的缓冲液为含 0. 05% Proclin-300的PBS溶液，所述供体微球的缓冲溶液为终浓度为25mM 4-羟乙基哌 嗪乙磺酸（HEPES)，IOOmM NaCl 和 0· 05% Proclin-300, ρΗ7· 4 的溶液。
[0016] 利用如上所述的黄曲霉毒素 Bl检测试剂盒检测黄曲霉毒素 Bl的检测方法，包括 以下步骤：
[0017] 1)将所述黄曲霉毒素 Bl标准品配置成具有浓度梯度的标准品；
[0018] 2)反应板每孔加入所述受体微球，生物素化黄曲霉毒素 Bl抗原；之后，分别在各 孔加入待测样品、步骤1)制备的标准品；
[0019] 3)振荡，室温或37°C避光孵育5min~IOmin ;
[0020] 4)每孔加入所述供体微球，振荡条件下，室温或37°C避光孵育5min~IOmin ;
[0021] 5)结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；
[0022] 6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应 标准曲线，即可获得检测样品中黄曲霉毒素 Bl的含量。
[0023] 如果待检样品为固体时，要对样品进行前处理，提取上清液进行检测。
[0024] 如上所述的检测方法，优选地，采用80 μ L反应体系，所述受体微球的加入量为 25yL，所述生物素化黄曲霉毒素 Bl的加入量为IOyL,所述样品或标准品的加入量为 35 μ L，所述供体微球的加入量为10 μ L。
[0025] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤（3)中37°C避光孵育的时间为lOmin，所 述步骤（4)中37°C避光孵育的时间为lOmin。
[0026] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤（6)检测结果分析包括：
[0027] a.用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光计数值除以黄曲霉毒素 Bl浓度为0 的荧光计数值再乘以1〇〇%，得到百分荧光计数值；以黄曲霉毒素 Bl标准品浓度的半对数 值为X轴，百分荧光计数值为Y轴，绘制标准曲线图；
[0028] b.按步骤a所述的百分荧光计数值计算方法，计算所述待测样品的百分荧光计数 值，相对应该待测样品的百分荧光计数值，则可从标准曲线上读出所述待测样品中黄曲霉 毒素 Bl的含量。
[0029] -种检测黄曲霉毒素 Bl的方法，包括如下步骤：
[0030] 1)配置具有浓度梯度的黄曲霉毒素 BI作为标准品；
[0031] 2)反应板每孔加入包被有黄曲霉毒素 Bl抗体的受体微球，生物素化黄曲霉毒素 Bl抗原；之后，分别在各孔加入待测样品、标准品；
[0032] 3)振荡，室温或37°C避光孵育；
[0033] 4)每孔加入包被链霉亲和素的供体微球，振荡条件下室温或37°C避光孵育；
[0034] 5)结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；
[0035] 6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应 标准曲线，即可获得检测样品中黄曲霉毒素 Bl的含量。
[0036] 本发明提供的黄曲霉毒素 Bl的检测试剂盒，通过特异性的抗原抗体反应将纳米 微珠对极大的拉近，级联化学发光反应将信号放大，有效的提高黄曲霉毒素 Bl检测的精 度。该检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特 异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。
[0037] 采用本发明提供的黄曲霉毒素 Bl检测方法，进行黄曲霉毒素 Bl的检测时，操作简 单、混合后即可测定，避免了传统免疫分析中洗脱、分离等繁琐过程，一方面，有效降低了非 特异性反应的可能性以及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面 大大缩短检测时间，并可在现场快速检测粮食谷物中的黄曲霉毒素 Bl残留，检测全过程控 制在20min之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。
[0038] 利用本发明提供的黄曲霉毒素 Bl的检测试剂盒，进行黄曲霉毒素 Bl检测的检测 灵敏度为〇. 005 μ g/L，高出现有技术ELISA的检测灵敏度。
【附图说明】
[0039] 图1是本发明一优选实施例检测黄曲霉毒素 Bl的标准曲线。
【具体实施方式】
[0040] 本发明的黄曲霉毒素 Bl检测的原理，采用抑制法均相免疫检测待测样品中的黄 曲霉毒素 B1。当样品中没有黄曲霉毒素 Bl时，反应液中的生物素化黄曲霉毒素 Bl抗原， 与偶联有黄曲霉毒素 Bl抗体的受体微球结合，再加入