一种处理液以及采用其测定铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及吸附型灭活疫苗中抗原解吸附 的处理液及所述抗原的含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 乙型脑炎病毒抗原是乙型脑炎灭活疫苗中的主要有效成分，其有效含量与疫苗接 种后的保护效果直接相关，因此，其抗原含量是乙型脑炎灭活疫苗质量控制中的一项重要 检测项目。
[0003] 目前，对乙型脑炎病毒抗原含量的检测大多采用酶联免疫吸附法，其原理是将可 溶性的乙型脑炎病毒单克隆抗体或高纯度的多克隆抗体吸附在酶联反应板上，使供试品中 的待检抗原与其发生特异性结合，再加入酶标抗体，使其与吸附在酶联反应板上的抗原结 合形成免疫复合物，通过酶反应底物在酶的作用下产生显色反应，并根据颜色变化对供试 品中的抗原做定量分析。这种方法具有操作简便、准确度高等优点，但是其检测结果易受供 试品中其他非抗原成分的干扰，出现假阳性或假阴性结果。并且，乙型脑炎灭活疫苗中的抗 原为灭活病毒抗原，在接种后诱导机体产生的免疫反应要弱于减毒疫苗，因此，为了使接种 者更有效的获得免疫，常需要加入佐剂制备成吸附型疫苗，诱导机体对病毒抗原产生免疫 识别。铝盐佐剂是目前惟一可用于人体的佐剂，这类佐剂包括氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、 铝佐剂。它们会与抗原表面携带的负电荷基团发生共价或配位结合，以颗粒的方式包裹抗 原，与可溶性抗原一起形成沉淀，从而使复合物更具免疫性。铝盐佐剂与抗原的结合屏蔽了 抗原表面的特异性结合位点，进而在抗原的体外检测过程中，抗原无法与酶联反应板或酶 标抗体上的特异性抗体相结合，从而导致抗原检出量偏低或无法检出。针对这一类吸附疫 苗还没有成熟的抗原含量检测方法，特别是对吸附乙型脑炎疫苗的病毒抗原检测，也未见 文献报道。
[0004] 目前国外对于铝盐吸附疫苗中的抗原含量检测也仅处于研究阶段。相关研究表明 铝盐佐剂与抗原之间的相互吸附作用主要是通过以下三种方式实现：静电吸引力、疏水作 用以及配基交换作用。为了能够准确测定吸附疫苗中的病毒抗原，需要首先破坏抗原与佐 剂之间的这三种相互作用力，使抗原先从佐剂上解离下来，暴露出抗原表面上相应的抗原 决定簇，再通过酶联免疫吸附法或电泳等方法对其进行检测。据文献报道，一些金属离子螯 合剂、表面活性剂、有机酸、乙二醇等物质可以针对抗原与佐剂之间存在的一种或几种相互 作用力进行破坏，达到解离抗原的目的。因此，以这些化学物质为基础设计的样品处理液屡 见报道，主要有如下两种样品处理液：
[0005] 以不同浓度的表面活性剂(包括十六烷基磺酸钠，曲通-100,西氯吡铵，盐酸胍)作 为样品处理溶液，其作用机理可能是通过表面活性剂与抗原的交联作用使其从铝佐剂上解 离下来。文献表明，使用IOmM的阳离子表面活性剂西氯吡啶处理氢氧化铝佐剂吸附的卵清 蛋白疫苗，其解离效果最好，卵清蛋白的回收率可达50%。但是，几乎所有的表面活性剂都会 或多或少的对蛋白质的结构造成破坏，引起蛋白质变性，因此抗原回收率很少达到60%。同 时，不同蛋白质的理化性质不同，对同一种表面活性剂的耐受程度也会存在较大的差异。吸 附乙型脑炎灭活疫苗中的乙脑抗原在阳离子表面活性剂以及阴离子表面活性剂中均较易 受到破坏：实验表明，使用5mM的西氯吡啶溶液或使用浓度为0. 1-5%的十二烷基磺酸钠溶 液对铝佐剂吸附乙型脑炎灭活疫苗处理5分钟，都会对乙脑抗原表面的特异性靶点结构造 成损害，导致抗原无法检出。在表面活性剂中，尿素属于温和变性剂，对抗原结构的影响较 小，但将其应用于吸附乙型脑炎灭活疫苗的解吸附，其抗原回收率也仅有20%左右，这表明 乙型脑炎病毒抗原的结构容易受到表面活性剂的破坏，表面活性剂并不适宜作为吸附乙型 脑炎灭活疫苗样品的处理液。
[0006] 另一种样品处理溶液为羊组织间液，使用该溶液孵育吸附型疫苗，相当于模拟吸 附型疫苗在体液环境中缓慢解离并释放抗原的过程，这种样品处理液与上述的表面活性剂 处理液相比，可以更加缓和的释放抗原，也不会对抗原蛋白结构造成大规模破坏。但这种方 法的应用受限于抗原的理化性质，例如：对于与氢氧化铝佐剂吸附系数为〇. 086的卵清蛋 白，需要反应4小时才能完全解吸附；对于与氢氧化铝佐剂吸附系数为6的乙肝抗原，在作 用48小时后，其抗原解离率还不到1%。除此之外，羊组织间液还具有不易制备，成本较高， 检测耗时长等缺点，难以推广。因此，Stanley LHem等人针对羊组织间液中的主要有效成 分进行了进一步的研究，他们认为羊组织间液中含有的一些成分可以与铝佐剂更强有力的 结合，从而解除铝佐剂与抗原之间的配基交换作用，将抗原解离下来。但是，这种建立在模 拟体液环境下的样品处理液，与羊组织间液一样，仅能够对铝佐剂-抗原之间的配位交换 作用力起到一定程度的破坏作用，而对于含有多种相互作用力的铝盐佐剂-复合物，则起 不到很好的解吸附效果。实验表明，使用这种样品处理液对吸附乙型脑炎疫苗处理48小 时，其解吸附率仅达到30%。这表明乙型脑炎抗原与铝盐佐剂之间的吸附机制不仅仅是配基 交换作用，可能同时包含较强的疏水作用力、静电吸引力。
[0007] 因此，有必要针对乙型脑炎抗原与铝佐剂之间的强吸附特点，开发一种新型样品 处理液，从而突破现有技术障碍，使其可以同时破坏抗原与佐剂之间较强的配位交换作用 力、疏水作用力以及静电吸引力，在较短时间内解离80%以上的抗原，并可以通过酶联免疫 法或电泳等方法对解离后的乙型脑炎抗原进行准确定量。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是要克服现有方法还不能够对吸附型乙型脑炎灭活疫 苗中的抗原含量进行体外检测，以打破无法直接对该疫苗中抗原含量进行有效的质量控制 这一难题，最终目的在于提供一种准确、有效的方法检测吸附型乙型脑炎灭活疫苗中的抗 原含量。
[0009] 因此，本发明的一个目的是提供一种用于解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的处理 液。本发明的另一个目的是提供采用该处理液检测铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法。本 发明的又一个目的是提供该处理液在配制铝盐吸附型疫苗中抗原含量的检测试剂中的用 途。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明主要通过以下技术方案实现：
[0011] 一方面，本发明提供一种用于解吸附铝盐吸附型疫苗中的抗原的处理液，所述处 理液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，并包含蛋白质以及一种或多种酸和/或它们的 盐。本发明提供的这种处理液将会对铝盐吸附型灭活疫苗、特别是乙型脑炎灭活疫苗中的 抗原与铝佐剂进行解吸附处理，使得被解吸附的抗原能够用于采用酶联免疫乙脑病毒抗原 检测试剂盒或电泳方法对其含量进行测定。
[0012] 优选地，所述处理液的pH为6. 5-9.0。优选地，所述处理液为0.02-2. Omol/L pH6. 5-9. 0的磷酸盐缓冲液；所述pH更优选为7. 0-8. 5,进一步优选为7. 0。
[0013] 在所述处理液中，所述酸为选自以下的有机酸：水合或非水合的柠檬酸或酒石酸； 所述盐优选为柠檬酸钠或酒石酸钠；
[0014] 优选地，所述酸和/或它们的盐在所述处理液中各自的浓度为100 - 1000 meq. /L。
[0015] 并且，所述蛋白质为白蛋白，优选血清白蛋白；优选地，所述蛋白质在所述处理液 中的浓度为10 - 30% (w/v)，优选30% (w/v)。
[0016] 根据本发明的【具体实施方式】,所述处理液为含有0. 05mol/L氯化钠、1000 meq./L 柠檬酸和30%牛血清白蛋白的2. 0mol/L pH7. 0的磷酸盐缓冲液。
[0017] 另一方面，本发明一种用于检测铝盐吸附型疫苗中抗原含量的方法，所述方法包 括：采用本发明提供的上述处理液处理待检测疫苗。
[0018] 优选地，所述方法包括以下步骤：
[0019] (1)将待检测疫苗配制成溶液，然后与所述处理液混匀后孵育；
[0020] (2)采用酶联免疫吸附法检测步骤（1)得到的混合液中的抗原含量。
[0021] 其中，所述疫苗优选为乙脑灭活疫苗，所述抗原优选为乙脑病毒抗原；