一种免疫磁性微球的制备方法、以及含有免疫磁性微球的苏丹红检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析检测领域，具体涉及一种免疫磁性微球的制备方法、以及含有免 疫磁性微球的苏丹红检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 苏丹红是一种化学染色剂，被广泛用于溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等的 增光方面。它并非食品添加剂，但由于其染色鲜艳，常被非法添加到辣椒粉等调味品中。它 的化学成份中具有偶氮结构，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性，对人体的肝 肾器官具有明显的毒性作用，因此被严禁添加到食品中。
[0003] 目前苏丹红的检测方法有高效液相色谱法、液质联用等，虽然这些方法灵敏度高， 但前处理操作复杂，仪器价格昂贵，且需要专业的技术人员进行检测，不适合快速筛查大批 量样品。目前可用于现场快速检测的方法如酶联免疫吸附试验（ELISA)，相比之下应用起来 较为灵活，但检测复杂样品时，待测样品中的基质影响较大，不利于低含量苏丹红样品的检 测。因此，急需开发一种能够避免处理复杂样品时受基质影响较大的检测方法，从而可以避 免检测样品时基质的影响，准确检测到待测样品中苏丹红的浓度。
[0004] 磁性微球表面带不同的化学官能团，如羧基C00H、氨基NH2、二氧化硅Si0 2、C18、环 氧基、链霉亲和素 、Protein A等。磁性微球具有单分散性好、磁响应强、稳定性好、亲水性 强、表面官能团含量高等特点。近年来，免疫磁性微球越来越广泛地应用于生物分离纯化、 免疫分析、生物检测等领域，显不出灵敏度1?、方便、快捷、1?效、复杂样品基质影响小等特 点。免疫磁性微球的制备一般为通过化学共价偶联，如EDC (碳二亚胺)法等，通过活化磁性 微球，使磁性微球上活化的基团与抗体或抗原共价结合，将抗体或抗原偶联到磁性微球上， 从而形成免疫磁性微球(或免疫磁珠)。但是，某些免疫磁性微球的制备过程中，偶联效率 较低，贮存稳定性较差，严重影响了免疫磁性微球的应用。
【发明内容】
[0005] 为克服免疫磁性微球制备过程中偶联率低、稳定性差的缺陷，本发明的目的是提 供一种免疫磁性微球的制备方法。
[0006] 本发明提供的免疫磁性微球制备方法，包括磁性微球活化的步骤以及磁性微球与 抗体或抗原偶联的步骤，其中，所述活化和/或偶联的步骤中采用以下缓冲液：包含体积百 分比为0. 01%~0. 1%的吐温-20以及质量百分比为0. 01%~0. 1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 的磷酸盐缓冲液（PB缓冲液)。
[0007] 优选地，所述缓冲液为包含体积百分比为0. 01%~0. 05%的吐温-20以及质量百 分比为0. 01%~0. 05%的聚乙烯吡咯烷酮的PB缓冲液。
[0008] 优选地，所述PB缓冲液的浓度为10~20mM (毫摩尔/升)，pH值为5. 8~6. 2。
[0009] 其中，所述磁性微球为表面带有羧基的磁性微球；所述抗体为苏丹红单克隆抗体； 优选地，所述磁性微球的粒径为1~3 μ m，羧基含量为200~300 μ moL/g。
[0010] 为克服现有苏丹红检测过程中易受样品基质影响的缺陷，提供一种快速、准确的 苏丹红检测方案，本发明的另一目的是提供一种含有免疫磁性微球的苏丹红检测试剂盒。 [0011] 此外，本发明的还一目的是提供苏丹红的检测方法。
[0012] 本发明提供的含有免疫磁性微球的苏丹红检测试剂盒，包括以下组分：
[0013] (1)按照以上技术方案任一项所述免疫磁性微球制备方法制得的苏丹红单克隆抗 体结合的免疫磁性微球；（2)苏丹红酶结合物；（3)样品稀释液；（4)苏丹红标准品溶液； (5)底物显色液；（6)终止液；（7)洗涤液。
[0014] 其中，所述苏丹红酶结合物为辣根过氧化酶（HRP)标记的苏丹红抗原。
[0015] 其中，所述样品稀释液为包含5%~10%体积的甲醇、0. 05%~0. 1%体积的乳化剂 丁父-100(1'1^〇11乂-100)的0.01~0.021磷酸盐缓冲生理盐水（？85)，其？!1值为7.2~ 7. 4。
[0016] 其中，所述苏丹红标准品溶液为苏丹红标准品溶于所述样品稀释液所得溶液，浓 度分别为：〇ng/mL、0. 2ng/mL、0. 6ng/mL、I. 8ng/mL 和 5. 4ng/mL。
[0017] 其中，所述底物显色液由A液和B液组成，显色液的A液为过氧化脲显色液，B液 为四甲基联苯胺（TMB)显色液。
[0018] 其中，所述终止液为1. 8~2. OM的硫酸溶液。
[0019] 其中，所述洗涤液为包含0. 1%~0. 5%体积的吐温-20的10~20mM磷酸盐缓冲 生理盐水（PBS)，其pH值为7. 0~7. 4。
[0020] 本发明提供的苏丹红检测方法为：采用以上技术方案任一项所述的试剂盒检测待 测样品中的苏丹红。
[0021] 本发明提供的免疫磁性微球制备方法使用了含有吐温-20以及聚乙烯吡咯烷酮 的PB缓冲液，相对于目前常用的缓冲液，能够起到良好的增溶、分散和保护作用，有利于磁 性微球与抗体或抗原进行偶联，偶联率明显提高。所得免疫磁性微球稳定性好，能在2~ 8 °C条件下保存一年以上，也不发生脱落现象。
[0022] 本发明提供的试剂盒采用了酶联免疫检测原理的直接竞争法，检测时间短，能同 时检测大批量样品。本发明提供的试剂盒使用了苏丹红单克隆抗体包被的免疫磁性微球， 灵敏度高、方便快捷，可用于大批量样品的快速筛查。
[0023] 本发明提供的检测方法与常规的微孔板ELISA法相比，由于采用磁性微球进行了 磁分离，故可避开待测样品时基质的影响，准确检测到样品中苏丹红的浓度。此外，本发明 的检测方法还有对待测样品需求量少、对仪器设备要求低、试剂保存时间长等优点，可以在 食品安全检测中发挥重要作用，有重大的社会意义和广阔的市场前景。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例3中采用本发明试剂盒检测得到的苏丹红标准曲线图；
[0025] 图2为实施例3中采用微孔板ELISA检测得到的苏丹红标准曲线图；
[0026] 图3为实施例7中本发明试剂盒的稳定性检测结果，时间间隔为7天，在37°C条件 下保存。
【具体实施方式】
[0027] 本发明实施方式中涉及到的百分号" ％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液 的百分比，除另有规定外，是指溶液IOOmL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在 20°C时的体积比例。如无特别说明，本发明实施方式中涉及到的操作均为本领域的常规操 作，涉及的试剂均为常见市售试剂。
[0028] 本发明的一个方面提供了一种免疫磁性微球的制备方法，包括磁性微球活化的步 骤以及磁性微球与抗体或抗原偶联的步骤，其中，所述活化和/或偶联的步骤中采用以下 缓冲液：包含体积百分比为〇. 01%~〇. 1%的吐温-20以及质量百分比为0. 01%~0. 1%的 聚乙烯吡咯烷酮（PVP)的磷酸盐缓冲液（PB缓冲液)。
[0029] 免疫磁性微球的制备过程通常为：将表面带有化学官能团的磁性微球在活化缓冲 液中通过活化剂进行活化，再将活化后的磁性微球置于偶联缓冲液中，在其中与抗体或抗 原进行偶联反应，偶联反应完毕后封闭磁性微球表面未反应的位点，然后将得到的免疫磁 性微球进行使用或将其分散于贮存液中进行保存。磁性微球的活化多使用MES (2-吗啉乙 磺酸)作为缓冲液，但本发明人发现，在某些磁性微球与抗体或抗原的偶联反应中，使用MES 缓冲液所得的偶联率较差，且所得免疫磁性微球稳定性较差，容易产生凝集现象。经过大量 实验，本发明人采用了上述PB缓冲液作为活化和/或偶联缓冲液，能够起到良好的增溶、分 散和保护作用，从而有效提高了偶联率，并提高了免疫磁性微球的稳定性。
[0030] 优选地，所述PB缓冲液包含体积百分比为0. 01%~0. 05%的吐温-20以及质量百 分比为0. 01%~0. 05%的聚乙烯吡咯烷酮。
[0031] 优选地，PB缓冲液的浓度为10~20mM，pH值为5. 8~6. 2。
[0032] 在一个具体的实施方式中，免疫磁性微球的制备方法包括以下步骤：
[0033] ( 1)将磁性微球用活化缓冲液洗涤2~3次后，分散在活化缓冲液中。
[0034] (2)加入活化剂混合反应，其中所述活化剂为EDC和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺）的 混合物。
[0035] (3)将活化后的磁性微球用偶联缓冲液洗涤2~3次后，分散在偶联缓冲液中。
[0036] (4)加入抗体或抗原，进行偶联反应。
[0037] (5)加入封闭液，封闭免疫磁性微球表面未反应的位点。
[0038] (6)使用所得的免疫磁性微球，或将其用贮存液洗涤2~3次后，分散在贮存液中。
[0039] 其中，EDC和NHS的加入量可由本领域技术人员根据具体需要确定