狂犬病毒均质荧光复合微球的制备方法及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及狂犬病毒均质荧光复合微球的制备方法及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 狂犬病毒（Rabies virus，RV)的糖蛋白（简称RVG)是唯一能刺激机体产生中和抗 体的病毒蛋白，同时也是很好的检测抗原。因此，将狂犬病毒糖蛋白在大肠杆菌中进行高效 表达，经Western blot等方法验证纯化后的重组蛋白可与RV阳性血清产生特异性反应，这 为RV抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。
[0003] 时间分辨突光分析法（Time-resolved Fluoroimmunoassy，TrFIA)利用綱系兀素 螯合物标记抗原、抗体、多肽、激素等，发生如抗原/抗体免疫反应、生物素/亲和素反应等 反应后，加入增强液解离镧系元素，使其荧光信号得到加强，再经外源性脉冲光激发，并采 用延时读取等光电技术检测镧系元素的特异荧光，从而达到对样品分析检测的目的。由 于发光物质铕离子和螯合剂结合后与包被的抗原或抗体进行免疫反应，形成的抗原-抗 体-铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，须加入增强 液（β-酮体、T0P0、Triton X-100、pH2-3的醋酸和邻苯酸氢钾的酸性溶液)，使稀土离子从 络合物上离下来，与新的络合物结合形成大分子的微囊，这种微囊将能量传递给Eu 3+，阻断 水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，利于荧光测量。可见，增强液在 TrIFA中是不可或缺的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供狂犬病毒均质荧光复合微球的制备方法及其检测方法。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 狂犬病毒均质荧光复合微球的制备方法，包括以下步骤： 1) 制备聚苯乙烯纳米微球； 2) Eu3+的标记：将聚苯乙烯纳米微球悬浮于无水乙醇，加入络合剂BHHCT，避光反应 15~25min，用无水乙醇洗涤，Tris-HCl缓冲液重悬后，加入EuCl 3，避光反应16~25min ; 离心，再用无水乙醇重悬沉淀，加入氨基硅烷，避光反应1. 5~2. 5小时，洗涤，得均质荧光 复合微球； 3) 抗原的标记： a、 取均质突光复合微球，重悬于无水乙醇，加入碳化二亚胺，避光反应23~35min ; b、 离心，磷酸盐缓冲液重悬，加入狂犬病毒抗原，避光反应12~20h ; c、 加入20%BSA溶液，反应22~35min ; d、 离心，洗涤，得到用于检测狂犬病毒的标记狂犬病毒抗原的均质荧光复合微球。
[0006] 优选的，步骤1)中，将聚乙烯吡咯烷酮、过硫酸钾、苯乙烯以质量比25:0. 6:100溶 于乙醇水溶液，氮气保护下进行聚合反应；离心，用无水乙醇重悬沉淀，加入氨基硅烷，避光 反应1. 6~3小时，洗漆，制得聚苯乙烯纳米微球。
[0007] 优选的，超声条件下，52~65 °C，进行聚合反应。
[0008] 优选的，步骤2)中，BHHCT与聚苯乙烯纳米微球的质量比为1:50。
[0009] 优选的，步骤3)中，均质荧光复合微球与碳化二亚胺的质量比为1:1。
[0010] 狂犬病毒的检测方法，包括以下步骤： 1) 用pH7. 4、0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液将重组金黄色葡萄球菌蛋白A稀释后，加入到 酶标板孔内，每孔100 μ L，2~8°C放置13~18小时； 2) 每孔加入200 μ L封闭液，2~8°C放置13~18小时； 3) 弃去板内液体，洗板，晾干； 4) 将标准品或待检样品加入到酶标板孔内，每孔100 μ L，37°C孵育； 5) 弃去板内液体，洗板，晾干； 6) 将权利要求1~5任意一项所述方法制备的狂犬病毒均质突光复合微球稀释后，加 入到酶标板孔内，每孔100μ L，37°C孵育； 7) 弃去板内液体，洗板，晾干； 8) 以多功能酶标仪的时间分辨突光模式检测突光信号，激发光波长为330nm，发射光 波长为6IOnm ; 9) 以标准品浓度的对数值为横坐标，测得相对荧光单位的对数值为纵坐标，获得标准 曲线，对比待检样品的检测值，判定结果。
[0011] 优选的，步骤1)中，重组金黄色葡萄球菌蛋白A的稀释浓度为2μ g/mL。
[0012] 优选的，步骤6)中，狂犬病毒均质荧光复合微球的稀释倍数为5000倍。
[0013] 优选的，步骤4)孵育60min，步骤6)孵育。
[0014] 优选的，封闭液含pH7. 4、0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，4%BSA，0. 01%的NaN3。
[0015] 本发明的有益效果是： 本发明在传统TrFIA基础上，用纳米微球作为荧光物质Eu3+的载体，即在功能化内核的 聚合作用下形成均质荧光复合微球，然后通过螯合作用交联RVG。本发明使用的双功能络 合剂BHHCT由于只有一个氯磺酞基，一端与稀土元素连接，一端与抗原或抗体连接，避免了 蛋白质分子之间的交联反应，且由于荧光物质Eu 3+没有和生物大分子直接接触，不会影响 生物活性，不需要进行解离和增强。并且，均质荧光复合微球表面覆有氨基硅烷形成的保护 层，荧光信号受外界环境影响降低，狂犬病毒均质荧光复合微球的稳定常数高达1〇 1(1，荧光 寿命达到几百微秒，可很好的满足时间分辨荧光免疫分析的需要。
[0016] 本发明狂犬病毒均质荧光复合微球的制备方法简单，检测成本低，减少了操作步 骤和反应时间，更容易实现自动化操作；仪器读数更高，线性范围更宽，检测灵敏度明显高 于 ELISA。
【附图说明】
[0017] 图1为聚苯乙烯纳米微球的扫描电镜照片。
[0018] 图2为均质荧光复合微球的Eu3+荧光光谱。
[0019] 图3为实施例2均质荧光复合微球检测方法建立的标准曲线。
【具体实施方式】
[0020] 提高TrFIA灵敏度的关键是稀土元素络合剂。本发明使用的双功能络合剂4， 4' -二（1 "，1"，1"，2"，2"，3"，3" -七氟-4"，6" -己二酮-6" -基）-氯磺酰基-邻二苯基 苯（BHHCT)是Yuan等（Yuan，J，etal.，1998)研发的一种稳定的能发出强烈荧光的Eu 3+ 络合剂，它所含有的四配位基团比以往的β_二酮类络合剂在灵敏度上有了很大的提高。 BHHCT由于只有一个氯磺酞基，一端与稀土元素连接，一端与抗原或抗体连接，避免了蛋白 质分子之间的交联反应。
[0021] 以下实施例中所用金黄色葡萄球菌细胞壁的重组蛋白A (重组蛋白SPA)购自北京 义翘神州生物技术有限公司；荧光螯合物BHHCT、重组狂犬病毒抗原RVG由北京泰普生物技 术公司馈赠；抗犬温热病毒抗体、抗犬细小病毒抗体购自Hytest ;ELISA试剂盒购自北京北 瑞达医药科技有限公司；标准品质控血清由本实验室保存。
[0022] 实施例1 狂犬病毒均质突光复合微球的制备： (1)功能化内核聚苯乙烯纳米微球的制备 将2.58聚乙烯吡咯烷酮（？￥?)、0.068过硫酸钾（即5)、1(^苯乙烯（5〇加入到2501111 无水乙醇/水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气，开启超声波发生器，60°C下进行 聚合反应，得到聚苯乙烯纳米微球分散液。离心收集沉淀，以无水乙醇悬浮，加入氨基硅烷， 室温搅拌反应，无水乙醇洗涤后收集聚苯乙烯纳米微球，无水乙醇悬浮保存备用。
[0023] (2 ) Eu3+标记纳米微球 将纳米微球悬浮液浓缩至20mg/mL，向5mL悬浮液加入0. 5mL的4mg/mL BHHCT的乙 醇溶液，室温避光搅拌反应20min ;以无水乙醇洗涤，Tris-HCl缓冲液重悬，加入0. 5mL的 0. 01mol/L EuCl3溶液，室温避光搅拌反应20min ;离心收集后再以无水乙醇悬浮，