血管紧张素Ⅰ检测试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种用于检测血管紧张素 I的化学发光免 疫检测试剂盒。本发明还涉及该试剂盒的制备方法，以及使用该试剂盒来检测血管紧张素 I浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 血管紧张素 I (Angiotensin I，A I )是由肾素作用于肝脏分泌的血管紧张素原 而产生，A I产生的速率是表示肾素活性（PRA)的重要指标之一。
[0003] 肾素-血管紧张素-酸固酬系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)是一个激素系统，当大量失血或血压下降时，肾脏分泌肾素，肾素催化血管紧 张素原水解产生A I，A I基本没有生物学活性，而是经血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Emzyme，ACE)剪切C-末端两个氨基酸残基而形成A II。A II具有高效的收缩 血管作用，从而使血压升高。A II也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮能促进肾脏对水 和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。
[0004] 目前，临床上测定A I的方法主要有放射性免疫法、酶联免疫法等。例如，北京 北方生物技术研宄所生产的碘[125I]A I放射免疫分析药盒采用竞争法原理测定血浆中的 A I含量。加入样本和兔抗-A I抗体（蓝色）及125I-A I标记物（红色）后，125I-A I标记 物与样本中的A I竞争结合兔抗-A I抗体，加入驴抗兔免疫分离剂，充分摇匀后，室温放置 15min，3000转/分离心15min，去上清，测沉淀管的放射性计数（cpm)。样本中的A I浓度 依据由校准品浓度和对应的放射性计数建立的Log-Logit数学模型进行定量，从而检测样 本中的A I含量。
[0005] 然而，放射性免疫法及酶联免疫法存在诸多不足。例如，上述放射性免疫法存在放 射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，耗时长，灵敏度低，检 测范围窄，且不能实现全自动化的缺陷。传统的放射性免疫法或酶联免疫法方法检测时间 长，同时主要依靠纯手工加样等系列繁琐操作，效率低，容易导致实验结果误差大；由于酶 促反应不够彻底，且易受外部干扰因素影响，如温度、时间及材料浓度影响，因此检测时特 异性低，灵敏度差，检测范围窄。因此，本领域亟需一种在灵敏度高的同时提高检测试剂的 安全性和稳定性，操作更加简便，还能够借助分析仪器实现检测过程全自动化的检测A I 的检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测A I的 化学发光免疫检测试剂盒，以获得高的检测灵敏度和准确性，还能提高检测试剂的稳定性， 延长检测试剂的保存时间。
[0007] 本发明还提供用于检测A I的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。
[0008] 另外，本发明还提供根据本发明提供的A I化学发光免疫检测试剂盒的应用，尤 其是采用该试剂盒，通过全自动化学发光法进行A I检测的方法，减少操作时间，降低人为 操作误差，同时利用化学示踪标记物的特异性，提高检测灵敏度。
[0009] 根据本发明，提供了一种用于检测A I的化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒 包括组分A和组分B，所述组分A为A I抗原或A I抗原与蛋白载体的连接物，组分B为抗 A I抗体，所述组分A和组分B中的一种标记示踪标记物，另一种包被磁球。
[0010] 应理解，在本发明提供的上述试剂盒中，所述抗A I抗体可以是一种或多种抗A I 单克隆抗体和/或抗A I多克隆抗体。实际上，在本发明中所提及的抗体都可以是单克隆 抗体和/或多克隆抗体。
[0011] 本发明适用的蛋白载体可以选自本领域常用的蛋白载体中的至少一种。例如，所 述蛋白载体选自牛血清白蛋白（BSA)、人血清白蛋白（HSA)、兔血清白蛋白（RSA)、血蓝蛋白 (KLH)、牛IgG、人IgG、卵清蛋白（OVA)、肌红蛋白和甲状腺球蛋白中的至少一种。
[0012] 根据本发明，所述示踪标记物可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标 记物，例如选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、碱性磷酸酶和辣 根过氧化物酶中的至少一种，优选为N-(4-氨丁基）-N-乙基异鲁米诺（ABEI)。
[0013] 根据本发明，所述示踪标记物直接标记或者间接标记A I抗原（或其与蛋白载体 的连接物）或抗A I抗体。其中，间接标记包括但不限于通过异硫氰酸荧光素（FITC)与抗 FITC抗体体系或链霉亲和素（SA)与生物素（Biotin)体系间接标记。所述"直接标记"是 指ABEI直接与待测抗原或针对待测抗原的抗体连接进行标记；所述"间接标记"是指通过 中间媒介链接体系使得ABEI标记A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）或抗A I抗体，所 述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系。 本发明人发现，间接标记有利于减弱空间效应，有利于信号的放大，使得检测更加灵敏。
[0014] 根据本发明，A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）或抗A I抗体直接包被磁球， 或者通过FITC与抗FITC抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。所述"直接 包被"是指利用A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）或抗A I抗体直接对磁球进行包被； 所述"间接包被"是指通过中间媒介链接体系，使得A I抗原（或其与蛋白载体的连接物） 或抗A I抗体对磁球进行包被，所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体 体系或链霉亲和素与生物素体系。同样，间接包被的优点在于，有利于减弱空间效应，有利 于信号的放大，使得检测更加灵敏。
[0015] 适用于本发明的磁球也称为磁珠，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本 发明使用的磁球，是将纳米级的Fe 2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具 有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被 磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可 根据需要进行选择。
[0016] 本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0. 1-5 μ m，磁性微球还可以通过表面改 性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-C00H、-NH2。
[0017] 在一个具体实施例中，所述磁球为Fe2O3或Fe 304磁性纳米粒子与有机高分子材料 的复合体，并具有〇. 1-5 μ m的粒径；并且，所述磁球任选地通过表面改性而带有一种或多 种活性功能基团。
[0018] 根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒包括选自组分Al和组分A2中的任意一 种的组分，以及选自组分B1、组分B2和组分B3中的任意一种的组分；其中，组分Al为ABEI 直接标记的A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）；组分A2为链霉亲和素标记的ABEI和生 物素化的A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）；组分Bl为抗A I抗体直接包被的磁球； 组分B2为生物素化的抗A I抗体和链霉亲和素包被的磁球；以及组分B3为抗A I抗体标 记的FITC和抗FITC抗体包被的磁球。
[0019] 根据本发明的另一些实施方案，所述试剂盒包括选自组分Cl和组分C2中的任意 一种的组分，以及选自组分Dl、组分D2和组分D3中的任意一种的组分；其中，组分Cl为 ABEI直接标记的抗A I抗体；组分C2为链霉亲和素标记的ABEI和生物素化的抗A I抗体； 组分Dl为A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）直接包被的磁球；组分D2为生物素化的 A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）和链霉亲和素包被的磁球；以及组分D3为A I抗原 (或其与蛋白载体的连接物）标记的FITC和抗FITC抗体包被的磁球。
[0020] 根据本发明，所述试剂盒还可以包括A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）的低 点校准品和高点校准品，并任选地包括缓冲液。本发明所述低点校准品与高点校准品是两 者相对而言，其中"低点校准品"，是指将A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）用50%牛 血清制品稀释成浓度为〇.2-2ng/ml得到的校准品；而"高点校准品"是指将A I抗原（或 其与蛋白载体的连接物）用50%牛血清制品稀释成浓度为8-24ng/ml得到的校准品。
[0021] 根据本发明提供的试剂盒，所包含的各成分浓度优选如下：AI抗原为 0· 002-0. 01mg/ml ;抗AI 抗体为 0· 05-lmg/ml ;磁球为 0· 05-lmg/ml ;FITC为 0· 002-0.0 lmg/ ml ;抗 FITC 抗体为 0· 05-lmg/ml ;链霉亲和素为 0· 05-lmg/ml ;生物素为 0· 002-0. 01mg/ml ; 示踪标记物为0.2-lmg/l ;以及如果使用了蛋白载体，其浓度为2-10mg/l。上述各成分的浓 度均基于包含该成分的单独的试剂盒组分的量计。
[0022] 在本发明的一种实施方案中，在本发明的试剂盒中，在A I抗原（或其与蛋白载体 的连接物）上标记ABEI，并用抗A I抗体包被磁球。
[0023] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括标记A I抗原（或其与蛋 白载体的连接物）的ABEI、抗A I抗体包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
[0024] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括标记A I抗原（或其与蛋 白载体的连接物）的ABEI、生物素化的抗A I抗体、链霉亲和素包被的磁球、低点校准品和 尚点校准品。
[0025] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括标记A I抗原（或其与蛋 白载体的连接物）的ABEI、抗A I抗体标记的FITC、抗FITC多克隆抗体包被的磁球、低点 校准品和尚点校准品。
[0026] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括生物素化的A I抗原（或 其与蛋白载体的连接物）、链霉亲和素标记的ABEI、抗A I抗体包被的磁球、低点校准品和 尚点校准品。
[0027] 在本发明的另一种实施方案中，在本发明的试剂盒中，在抗A I抗体上标记ABEI， 并用A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）包被磁球。
[0028] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括标记抗A I抗体的ABEI、 A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）包被的磁球、低点校准品和高点校准品。
[0029] 例如，在本发明的一个具体的实施例中，所述试剂盒包括标记抗A I抗体的ABEI、 标记A I抗原（或其与蛋白载体的连接物）的FITC、抗FITC多克隆抗体包被的磁球、低点 校准品和尚点校准品。
[0030] 例如，在本发明的一个具