一种基于聚乙二醇修饰的传感器及其检测凝血酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于聚乙二醇修饰的传感器及其检测凝血酶(thrombin)的方法，具体涉及一种基于聚乙二醇(PEG)修饰的石墨烯氧化物(GO) —核酸适配体(aptamer)传感器及其检测凝血酶的方法，属于生物医学领域中的蛋白质检测方法。
【背景技术】
[0002]人的凝血酶是凝血连锁反应的主要效应蛋白酶。除了能够切割纤维蛋白原外，还发现能够特异性切割人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1) V3环保守的冠部并促进HIV-1介导的细胞融合；此外，thrombin及细胞表面thrombin受体表达的上调可能与HIV-1相关脑病的发生相关，thrombin在凝血系统的许多疾病中发挥着关键性作用。过量表达thrombin能够导致血栓形成，但是它若表达不足则可能导致血友病。因此，准确地监控thrombin对于确定给定病人的合适治疗方法是至关重要的(Liu S., Zhang X.Y., Luo ff.X.，WangZ.X.，Guo X.F.，Steigerwald M.L，Fang X.H.，Single-Molecule Detect1nof Proteins Using Aptamer-Funct1nalized Molecular Electronic Devices,Angewandate Chemie Internat1nal Edit1n, 2011， 50: 2496-2502.)。
[0003]GO制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且GO在与DNA相互作用时，有一个重要的特点，单链DNA通过Ji 一 Ji效应，能吸附到GO表面(Qian，Z.S.，Shan, X.Y.，Chaij L J.，Maj J.J.，Chen, J.R.，Fengj H.，Nanoscalej2014，6: 5671 - 5674.；He, Y.，Jiao, B.N.，Tangj Η.1，RSC Advances, 2014，35，8294 - 18300.)，aptamer 是一种单链 DNA，能特异性地结合 thrombin，当 thrombin 与aptamer特异结合后，aptamer会脱离GO表面,一些研究者基于这个特点,通过突光标记的aptamer 对 thrombin 进行特异性检测(Wang, L., Zhu, J.B., Han, L., Jin, L.H.,Zhu, C.Z., Wang, E.K., Dong, S.J., ACS Nano, 2012, 6, 6659 - 6666.；Bai, Y.F., Feng, F., Zhao, L., Wang, C.Y., Wang, H.Y., Ti an, M.Z., Qin, J., Duan,Y., L., He, X.X.，B1sensors and B1electronics, 2013, 47, 265 - 270.),但这个方法存在一个缺点:被检测的thrombin能非特异性地吸附到GO表面，从而阻止检测灵敏性的提高。为发展高灵敏、快速地、低成本地检测thrombin的方法，我们利用PEG阻止GO表面非特异性吸附的thrombin,提高检测的灵敏度,发展一种灵敏度较高的thrombin的检测方法。
【发明内容】
本发明目的是提供一种基于PEG修饰的GO传感器及其对thrombin的检测方法，PEG能阻止GO表面对thrombin的非特异性吸附,从而高灵敏、快速、低成本对thrombin进行检测。
[0004]—种基于PEG修饰的传感器，按照以下方法制备:
(1)制备GO:通过改良的Hummers法大批量制备G0，将GO真空干燥备用，使用前，在水溶液中超声分散；
(2)PEG的修饰:加入PEG，PEG通过自组装与GO表面相结合，阻止thrombin非特异吸附，加入的PEG的浓度为50 nM ；
(3)合成 thrombin 的 aptamer:5’ - GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’ 末端标记羧基荧光素(FAM)；
(4 )荧光淬灭:将aptamer加入到GO水溶液中，即制备成为基于PEG修饰的检测aptamer的GO-aptamer传感器；G0能够淬灭aptamer末端标记的FAM的突光；其中aptamer的浓度为5-40 nM ；G0的浓度为6 -50 Pg/mL ；
(5)thrombin的检测:加入thrombin, aptamer结合thrombin后，FAM的突光得到恢复，根据荧光强度的变化，从而对其进行检测。
[0005]基于PEG修饰的GO-aptamer传感器对thrombin检测方法为:
(I)制备GO:通过改良的Hummers法大批量制备G0，将GO真空干燥备用，使用前，在水溶液中超声分散。
[0006](2)PEG的修饰:加入PEG，PEG通过自组装与GO表面相结合，阻止aptamer非特异吸附，加入的PEG的浓度为50 nM ；
(3)合成thrombin 的 aptamer:5’ - GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’ 末端标记 FAM ；
(4)荧光淬灭:将aptamer加入到含有PEG的GO水溶液中，即制备成为基于PEG修饰的检测thrombin的GO-aptamer传感器；G0能够淬灭aptamer末端标记的FAM的突光；其中 thrombin 的浓度为 5_40 nM ；G0 的浓度为 6 -50 M-g/mL ；
(5)thrombin的检测:加入thrombin, aptamer结合thrombin后，FAM的突光得到恢复，根据荧光强度的变化，从而对其进行检测。
[0007]本发明具有以下优点:
1.本发明中GO易于获得，方法简单、成本低，充分利用GO能淬灭单链DNA末端标记的荧光，当蛋白质结合单链DNA后，荧光恢复的特点，能快速、特异性、高灵敏性对th1mbin进行检测。
[0008]2.本发明采用PEG阻止GO对thrombin的非特异性吸附，解决基于GO传感器检测thrombin中的非特异吸附的问题，从而增加检测的特异性，进一步提高检测的灵敏性。
【附图说明】
[0009]图1:本发明的流程示意图；
图2:基于GO传感器对thrombin灵敏性检测图；
图3:基于GO传感器对thrombin选择性检测图；
图4:PEG修饰GO传感器对thrombin检测的影响图；
图5:PEG修饰GO传感器对0.03 nM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-GO-PEG-0.03nM thrombin、aptamer-G0-PEG 检测结果曲线。
[0010]图6:PEG修饰GO传感器对0.01 nM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-GO-PEG-0.0lnM thrombin、aptamer-G0-PEG 检测结果曲线。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
[0012]实施例1:
(I)制备GO:通过改良的Hummers法大批量制备G0，在三口烧瓶中，加入3g鳞片石墨粉、1.5 g似勵3与69 mL浓硫酸后放入恒温水浴锅中搅拌。反应Ih后加入Ig KMnO4, 350C下反应5个小时后加入150 mL去离子水。在温度98°C下反应30 min后，再加入50 mL的去离子水、5 mL H2O2以及250 mL的10%稀盐酸，将溶液倒入1000 mL的大烧杯中，洗涤至PH值为5-6。将氧化产物