一种凝血酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种凝血酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶是具有高度专一性的丝氨酸蛋白水解酶，能直接促使血液中的纤维蛋白原 转化为纤维蛋白，并促使血小板聚集，达到迅速止血的目的。凝血酶由血液中的凝血酶原 (prot虹ombin)前体水解活化而来，凝血酶产品由提取的凝血酶原活化而来。20世纪中期 开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后证明将动物凝血 酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等。从 血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副作用的优 点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾病和血栓性 疾病的临床检测。
[0003] 目前，一般从牛、猪和人的血浆中制备凝血酶，对凝血酶的分离纯化主要包括有血 浆的前处理、提取和激活凝血酶原、制备凝血酶粗酶和凝血酶的纯化等步骤。凝血酶原的提 取方法主要有等电点法、巧樣酸领沉淀法、氨氧化儀吸附法和离子交换吸附法。凝血酶进行 纯化的方法目前主要有盐析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。
[0004] 等电点沉淀法根据蛋白质在溶液抑为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用 1 %的醋酸将适当稀释后的血浆抑调至凝血酶原的等电点5. 0-5. 5之间，即可使凝血酶原 析出。该方法虽然操作简便，成本较低，但得到的凝血酶含杂蛋白较多，比活性低。巧樣酸 领吸附法则根据巧樣酸领能吸附依赖于维生素K的凝血因子运一特性，在巧樣酸钢抗凝获 得的血浆中加入氯化领产生巧樣酸领，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用邸TA解 吸附，离屯、去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液。该方法提取凝血酶需要经过透析或 过柱除去领盐，工业化生产不易操作，生产周期长。 阳0化]中国专利文献（CN1031160486)公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括：首 先分离猪血浆，将血浆进行化学法病毒灭活；按照猪血浆总重量的1. 5%加入离子交换树 脂进行凝血酶原的吸附，在室溫下吸附40~60min后用滤布过滤收集离子交换树脂，洗涂 离子交换树脂，弃去洗涂液。然后将经洗涂液洗涂的离子交换树脂，用洗脱液进行洗脱，收 集洗脱液，将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析，去除多余的 盐类物质，得到凝血酶原溶液，将凝血酶原溶液用孔径为20nm的过滤器进行过滤，收集滤 液进行凝血酶原活化制备凝血酶的冻干保存。其中所述的离子交换树脂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂。上述方法采用离子交换树脂吸附凝血酶原后用透析去盐，又经纳米 过滤，活化后没有经过进一步纯化直接制备凝血酶。
[0006] 现有的制备方法，都是上述凝血酶原提取和凝血酶纯化方法的各种组合，但是不 论从动物血还是人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在W下问题：凝血酶产率 较低，效价不稳定；产品杂质偏高；运些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐 患，在制备过程中往往需要多次的纯化，W达到纯度较高的凝血酶。
【发明内容】
[0007] 为此，本发明针对现有技术中制备出的凝血酶产率较低、产品杂质偏高、工艺步骤 繁多等不足，提供一种工艺流程简单、生产周期短、成本低、纯度较高的新的制备凝血酶的 方法。
[000引为了解决上述技术问题，本申请的技术方案如下：
[0009] 一种凝血酶的制备方法，具体包括W下步骤：
[0010] (1)向血液中加入抗凝剂，离屯、分离，取上清抗凝血浆；
[0011] (2)向抗凝血浆中加入壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，揽拌吸附30-60min，过滤收集 壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涂液洗涂壳聚糖-精氨酸阴离子树脂2-3次；
[0012] (3)将上述洗涂后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂洗脱液洗脱2-3次，收集洗脱液， 得到凝血酶原溶液；
[0013] (4)对凝血酶原进行激活，得凝血酶粗溶液；
[0014] (5)将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖 亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的0. 5-2 %，室溫缓慢揽拌吸附30-60min，磁铁 分离吸附液；用含0.1mol/L化C1的0. 05mol/L，抑7. 2的化is-肥1缓冲液洗涂肝素-壳 聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L化C1的0. 05mol/L，抑7. 2的Tris-肥1 缓冲液作为洗脱液洗涂肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液；
[0015] (6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，真空冷冻干燥得凝血酶。
[0016] 上述凝血酶的制备方法中，所述抗凝剂为质量浓度为3. 8-4. 5%的巧樣酸钢溶液， 加入量为血液体积的5-10%。
[0017] 上述凝血酶的制备方法中，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入量为抗凝血浆质量的 0. 5-3%。
[0018] 上述凝血酶的制备方法中，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入前用平衡液进行预平 衡，方法为：将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡30-90min，用0. 08mol/L化C1的 0. 05mol/L，抑6. 8-7. 2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涂。
[0019] 上述凝血酶的制备方法中，步骤（2)中的洗涂液为0.1mol/L化C1的0. 05mol/l， pH 6. 8-7. 2 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0020] 上述凝血酶的制备方法中，步骤（3)中的洗脱液为Imol/L化C1的0. 05mol/L，抑 6. 8-7. 2 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0021] 上述凝血酶的制备方法中，凝血酶原进行激活的方法为；向凝血酶原溶液中加入 化C12溶液，使其终浓度为化 2+〇. Imol/L，25°C下激活2小时。
[0022] 将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入凝血酶粗溶液前进行预处理：将肝素-壳聚糖 亲和磁性微球加入蒸馈水中溶胀1-3小时，用0. 05mol/l，pH 7. 2的Tris-HCl缓冲液充分 平衡洗涂。
[0023] 上述凝血酶的制备方法中，所述血液为猪血、牛血、羊血或人血。
[0024] 本发明具有如下优点：
[00巧]1、本发明的凝血酶的制备方法，采用壳聚糖-精氨酸阴离子树脂吸附凝血酶原， 壳聚糖-精氨酸阴离子树脂是交联壳聚糖微球再交联精氨酸，呈弱碱性，用于吸附酸性蛋 白，从而分离凝血酶原。壳聚糖是自然界含量丰富、廉价易得的高分子材料，易生物降解、安 全无毒、生物形容性好，容易进行化学修饰。壳聚糖多孔微球具有树脂的多孔，并且关联精 氨酸后，给壳聚糖增加了阴离子活性和多分枝，增加了吸附性，可W较好的吸附凝血酶原。 壳聚糖相较于常用的树脂成本较低，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂洗涂之后经过一定的处理 可W重新利用。
[00%] 2、本发明的凝血酶的制备方法，采用肝素-壳聚糖亲和磁性微球进行凝血酶的纯 化，肝素-壳聚糖亲和磁性微球对凝血酶具有特异性吸附，利用磁铁分离在用于提高凝血 酶的活性和纯度，可W快速纯化凝血酶，并且纯化后的凝血酶比活性高，最高可为1928. 7， 肝素-壳聚糖亲和磁性微球经处理后可重复利用，大大降低了成本。
[0027] 3、本发明的凝血酶的制备方法，本发明的方法工艺流程简单，在常溫常压下进行 即可，并且可W应用于大规模生产，生产周期短、操作简单、整个工艺生产仅需2天。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过具体实施例进一步对本发明进行说明。
[0029]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原 料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0030] 本发明的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂和肝素-壳聚糖亲和磁性微球可按现有的方 法制备，其中：
[0031] 本发明的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂可按下述方法制备：
[0032] (1)制备交联壳聚糖-精氨酸阴离子树脂
[0033] 将脱乙酷度90% W上的壳聚糖加入盐酸质量百分数为5%乙酸溶液中，制备出壳 聚糖质量百分数为5%的壳聚糖溶液，后按壳聚糖酸性溶液：液体石蜡的体积比为1 :5的比 例，将壳聚糖酸性溶液缓慢加入液体石蜡中，揽拌20-30min，并加热升溫至25°C制得到壳 聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0. 15%戊二醒交联剂，再加入占壳 聚糖石蜡溶液质量分数为0. 05%碳酸巧致孔剂，进行制孔反应30min制得壳聚糖微球的悬 浮液，最后用氨氧化钢溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9-10,并加热至55-75°C，揽拌 固化2-地，再过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涂3-6次，后用质量分数为5%稀 盐酸溶解滤渣中的碳酸巧，再用蒸馈水洗涂至中性；得多孔壳聚糖微球。
[0034] 似壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备
[00对将第（1)步制备出的多孔壳聚糖微球，加入质量分数为2. 0%精氨酸溶液中，振荡 20-30min，制备出壳聚糖质量分数为1. 5%的壳聚糖-精氨酸溶液，然后按壳聚糖-精氨酸 溶液中精氨酸：二环己基碳二亚胺的摩尔比为1 :0. 5的比例，在壳聚糖-精氨酸溶液中，加 入DCC接肤缩合剂，进行缩合反应20-40min，最后经过滤，再弃滤液，再收集滤渣，得到壳聚 糖-精氨酸阴离子树脂。
[0036] 本发明的肝素-壳聚糖亲和磁性微球可按下述方法制备：
[0037] (1)将浓度分别为0. 3mol/L的化2\Fe3+溶液按摩尔比1 :2混合均匀的混合液，按 混合液与阳G4000体积质量比为100 (mL) :1再加入阳G4000,充分溶解后在磁力揽拌下快 速滴加到2. 5mol/L的化0H中，维持溶液抑值为9-11，继续揽拌30分钟，接着超声10分钟， 80°C水浴熟化30分钟后，再接着超声20分钟，此时溶液水解已趋于完全，变得均匀细腻，用 磁铁吸住底部倾去上清液，重蒸水冲洗至中性，抽滤，真空冷冻干燥的化304纳米磁核。
[00測 似将脱乙酷度90 % W上的壳聚糖溶解在5 %的乙酸溶液中，得到浓度为5 %的壳 聚糖乙酸溶液。按壳聚糖与化304纳米磁核质量比1. 5 : 1加入上述化304纳米磁核后超声分 散10分钟，在缓慢揽拌下逐滴滴入到由液体石蜡、Span-80、Tween-60、正下醇混合液中，超 声并电动揽拌10分钟，形成微乳溶液。其中液体石蜡、Span-80、Tween-60、正下醇的体积 为80 :2. 5 :1. 5 :2,液体石蜡的体积与壳聚糖体积比为5:1。停止超声后迅速滴加入体积为 微乳溶液体积5%的10%戊二醒溶液，在2000rpm转速下继续揽拌2小时。反应结束后用 磁铁将产物进行分离，再依次用石油酸、丙酬和重蒸水反复洗涂，洗去表面活性剂和有机溶 剂，抽滤，真空冷冻干燥为得到壳聚糖磁性微球。
[0039] (3)将制备的壳聚糖磁性微球，用适量重蒸水充分溶胀，加入Imol/L氨氧化钢溶 液，二甲基亚讽和环氧氯丙烷