检测FⅤ基因第10号外显子的方法和引物与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测FⅤ基因第10号外显子的引物和方法。

背景技术：

易栓症是由于抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等遗传性或获得性缺陷或存在获得性危险因素而容易发生血栓栓塞的状态，主要临床表现类型为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)。易栓症可分为遗传性易栓症与获得性易栓症，遗传性危险因素目前主要有：凝血因子V(factor V，FV)Leiden变异、蛋白C(PC)缺乏、蛋白S(PS)缺乏，凝血酶原G20210A(FIIG20210A)基因变异、抗凝血酶(AT)缺乏，高同型半胱氨酸血症等。近年来研究表明FII基因在易栓症中起到了重要的作用。凝血因子Ⅴ(factorⅤ，FⅤ)是凝血过程中一个重要的辅因子，是体内凝血酶原的最主要的激活物，是体内最不稳定的凝血因子。FⅤ位于第1号染色体，基因长74578bp，有25个外显子编码，其mRNA为9179bp，合成2224个氨基酸的肽链。蛋白FⅤ是一个相对分子质量为330×10³的单链糖蛋白，由A1-A2-B-A3-C1-C2共6个结构域组成。在凝血过程中，FⅤ在凝血酶的作用下，切去B结构，成为A1-A2结构域组成的重链和A3-C1-C2结构域组成的轻链所构成的活化形式，即FⅤa与FXa、Ca²⁺于磷脂表面形成凝血酶原激活物，从而激活凝血酶原使之成为具有活性的凝血酶。1994年，Bertina等报道FⅤ基因第10号外显子上的第1691位核苷酸G→A(1691G→A)的基因突变，64例有APCR现象的血栓形成患者中，56例携带有FⅤLeiden突变的等位基因。活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance，APCR)是深静脉血栓的重要危险因素。而抗APC症的本质是FⅤ基因第10外显子核苷酸1691处发生了G→A的突变，形成一种基因突变的FⅤLeiden，活化的FⅤ不能被APC灭活，使血液凝固加快而引起血栓。提出了FⅤ基因在血栓形成中的作用。

多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于FⅤ基因突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于FⅤ基因容量大、突变类型多、突变率高、突变位点散在分布,故而阻止了对FⅤ基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。

本发明采用Sanger测序法检测FⅤ基因第10号外显子的突变，并且设计的引物可以扩展整个10号外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解FⅤ基因第10号外显子的基因突变情况，并不受FⅤ基因的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。

技术实现要素：

本发明提供检测FⅤ基因第10号外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测静脉血栓患者体内FⅤ基因第10号外显子突变的情况。

扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子突变的正向引物(1691-F)和反向引物(1691-R)的碱基序列为：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

进一步地，所述引物还包括正向测序引物(1691-F)和反向测序引物(1691-R)，其碱基序列为：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

进一步地，所述扩增的正反向引物的使用浓度比为：1691-F：1691-R＝1:1。

进一步地，所述测序的正反向引物的使用浓度比为：1691-F：1691-R＝1:1。

本发明的目的还在于提供一种检测FⅤ基因第10号外显子的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)利用扩增引物1691-F与1691-R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测FⅤ基因第10号外显子突变的扩增产物；

(3)利用测序引物1691-F与1691-R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型FⅤ基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

本发明的目的还在于提供一种检测FⅤ基因第10号外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括扩增引物1691-F与1691-R，测序体系包括测序引物1691-F与1691-R，包括：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer；dNTPs；KOD FXDNA Polymerase。

进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。

本发明设计了扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子的正、反向引物，以及对所获得的扩增产物进行正反向测序的测序引物。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测FⅤ基因第10号外显子的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。

有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩展第10号外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解FⅤ基因第10号外显子的基因突变情况，并不受FⅤ基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。

附图说明

图1为FⅤ基因在染色体上定位图。

图2为1691-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-24为送检的患者血液样本1-24号，如图2所示，引物1691-F/R扩增有效，且条带单一。

图3样本3第10号外显子序列的正向测序结果。

图4样本6第10号外显子序列的正向测序结果。

图5样本3第10号外显子序列的反向测序结果。

图6样本6第10号外显子序列的反向测序结果。

方框部分为FⅤ基因第10号外显子序列G1691A的位置，图中测序结果显示这些样品均未发生突变。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测FⅤ基因第10号全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测FⅤ基因第10号外显子序列的正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

在检测中，先利用上述正、反向引物对覆盖检测FⅤ基因第10号外显子的DNA片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。

在引物设计上，所设计的每对引物都位于所要扩增的序列两侧，即扩增区域包括了该序列的全部序列。虽然FⅤ基因在静脉血栓患者中有较为主要的突变位点G1691A(在第10号外显子上)，但不明确的突变位点也很多，突变类型不定。因此本发明所述引物既能将所述外显子序列都扩增出来，也保证无论外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。

检测检测FⅤ基因第10号外显子的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中

检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；检测目的基因用的上、下游引物1691-F(10μm)与1691-R(10μm)。

测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：1691-F(3.2μm)与1691-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液配制如下：

其中，1691-F与1691-R的碱基序列为：

1691-F：5'TGCACAGTGCTTAACAAGACCA 3'

1691-R：5'CTTGAAGGAAATGCCCCATTA 3'

阳性对照品：含有FⅤ序列的溶液。

阴性对照品：无FⅤ序列的溶液。

空白对照品：1μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2

血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入2个检测体系PCR反应液中各1μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

(5)sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与测序引物：1691-F(3.2μm)与1691-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)检测。

(6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NC_000001.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取临床静脉血栓症患者样本24份，检测该24份样本是否存在FⅤ基因突变,样本编号1-24。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中1μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。

电泳结果如图2所示，表明本发明所述引物1691-F/R、对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样品3的第10号外显子序列的部分正向测序结果如图3所示，为野生型，未检测出FⅤ突变。

样品6的第10号全外显子序列的部分正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出FⅤ突变。

样品3的第10号全外显子序列的部分反向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出FⅤ突变。

样品6的第10号全外显子序列的部分反向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出FⅤ突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把序列包括在内了，能够扩展出FⅤ基因第10号外显子序列，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出FⅤ基因第10号外显子序列，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出FⅤ基因突变。