一种猪凝血酶冻干粉的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪凝血酶冻干粉的制备工艺，具体涉及一种猪凝血酶冻干粉的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶是在血液凝固系统中起重要作用的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋 白原的4个Arg-Gly肽键，使溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，促使血液凝 固，同时能促使血小板凝集，进一步加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[0003] 目前临床上使用的凝血酶制剂大部分为从牛血或猪血中提取的凝血酶原，经凝血 酶原激活物激活而得凝血酶的无菌冻干品，具有较高的专一性，是一种速效局部止血药，广 泛应用于消化道出血和外科手术止血。（宋宏新，马永征，李敏康.凝血酶分离纯化方法 的研究进展[J].食品研究与开发，2004, 25 (6) :65-67.)。
[0004] 猪凝血酶分子量约为35~39kDa，由两条多肽链通过一个二硫键连接而成，一条 链分子量约为34kDa，另一条链分子量约为5kDa;等电点（pi)为5. 0~5. 5,IEF电泳显示 为二条带，pi分别为5. 0、5. 4 (徐长法，王玉仙，刘德富，等.猪凝血酶的分离纯化与鉴 定[J].北京联合大学学报，1994, 8(1) :44-49.)。猪凝血酶的分离纯化过程大致包括猪血 浆的预处理、凝血酶原的提取、凝血酶原的激活及粗凝血酶的制备、凝血酶的纯化等步骤。 由于凝血酶制品是从猪血中提取制备而得的多组分生化药品，潜在有猪源性病毒污染的隐 患，为提高制品安全性，有必要开展凝血酶病毒灭活工艺研究。
[0005]
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种猪凝血酶冻干粉的制备方 法。
[0007] 本发明提供的猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
[0008] ⑴抗凝猪血浆与经过含有Na2B407 3. 75mmol/L和H3B03 85mmol/L且pH值为8. 0 的硼酸-硼砂缓冲液平衡的QAE-S印hadexA50凝胶按照1L: 1~1. 5g的用量混合，室温搅 拌吸附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗 至基线走平，再用0.lmol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0. 4mol/L的NaCl和2mmol/ L的BaCl2的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液；
[0009] (2)按兔脑粉与生理盐水为lg:20mL的比例，向兔脑粉中加入45°C的生理盐水，保 持45~50°C搅拌提取15~20分钟后，2000rpm离心5分钟，收集上清液；按照上清液：凝 血酶原溶液：CaCl2= 4. 7mL: 1L: 1. 4g的用量进行配比混合搅拌均匀后，于25~31°C水浴 中静置激活1~2hr进行酶原激活，然后于4°C5000rpm离心lOmin，用双层400目绸布过 滤，收集上清得凝血酶粗酶液；
[0010] (3)凝血酶粗酶液用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩10~20 倍，进液压控制在0. 15MPa以内，回流压控制在0.IMPa以内，浓缩后的粗酶液中加入病毒 灭活剂搅拌均匀后，于24~26°C下保温6~8hr，进行病毒灭活；所述病毒灭活剂包括终浓 度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的吐温-80 ;或者所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的 磷酸三丁酯和终浓度l〇g/L的TritonX-100〇
[0011] (4)灭活病毒后的粗酶液过DEAE-S印haroseFastFlow层析柱，先用平衡液流洗 至基线走平后，用洗脱液洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；
[0012] (5)步骤（4)所得猪凝血酶加入终浓度为15~35g/L的甘露醇或右旋糖酐40,过 滤除菌，分装，冻干，真空压塞，乳铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；
[0013] (6)猪凝血酶冻干品在100°C下进行干热处理30~120min以再次灭活病毒，然后 进行包装，即得猪凝血酶冻干粉。
[0014] 优选地，步骤（4)中所述平衡液为pH值7. 9且浓度为0. 02mol/L的PB缓冲液，洗 脱液为pH值7. 9,且含0· 2mol/LNaCl的浓度为0· 02mol/L的PB缓冲液。
[0015] 优选地，步骤（4)中，平衡液为pH值8. 0且浓度为0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液， 洗脱液为pH值8. 0,且含0· 2mol/LNaCl的浓度为0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
[0016] 优选地，步骤（5)中，甘露醇或右旋糖酐40的终浓度为25g/L。
[0017] 优选地，步骤（6)中，干热处理时间为60min。
[0018] 本发明还提供以上任一所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法获得的产品。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明猪凝血酶冻干粉的制备方法，通过两步层析柱分离，得到猪凝血酶，比活性 不低于130U/mg;同时使用S/D法灭活和干热灭活相结合的方式，有效灭活了制品中潜在的 外源性病毒，提高了制品安全性。整个工艺步骤简单、易实施，适合于工业化生产。本发明工 艺制备得到的猪凝血酶冻干粉制剂，潜在的猪源性病毒污染大大降低，提高了产品安全性。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明工艺的工艺流程示意图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0023] 实验材料：硼砂、硼酸、氯化钠、氯化钙、氯化钡、兔脑粉、QAE-SephadexA50凝胶、 DEAE-SepharoseFastFlow凝胶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三轻甲基氨基甲烧、盐酸、磷酸 三丁酯、吐温-80、TritonX-100、甘露醇、右旋糖酐40均为市售产品。
[0024] 实施例1本发明猪凝血酶冻干粉制剂的制备
[0025] 1、猪凝血酶的制备
[0026] (1)凝血酶原的制备
[0027] 取抗凝猪血浆40L;另取QAE-S印hadexA50凝胶干粉40g，用含3. 75mmol/L Na2B40#P85mmol/LΗ3Β03，ρΗ8. 0缓冲液溶胀并平衡好后，加入至该血浆中，室温搅拌吸附 2hr;用双层400目绸布过滤收集上述吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱；先用纯化水流 洗至基线走平，再用0.lmol/LNaCl流洗至基线走平，最后用含0. 4mol/LNaCl和2mmol/L BaCl2的洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得凝血酶原溶液8570mL。
[0028] (2)凝血活酶溶液的制备
[0029] 取兔脑粉5g，加入100mL预热至45°C的生理盐水，于45°C水浴中搅拌提取20分钟 后，2000转/分钟离心5分钟，收集上清液即得凝血活酶溶液。
[0030] (3)凝血酶原激活
[0031] 于步骤（1)制备的凝血酶原溶液中加入约40mL步骤⑵制备的凝血活酶溶液 和约12g无水氯化钙，搅拌均匀后，于25°C水浴中静置激活2hr;将激活后的粗酶液于 4°C5000rpm离心lOmin，用双层400目绸布过滤收集上清液，即得凝血酶粗酶液。
[0032] (4)超滤脱盐并浓缩粗酶液
[0033] 将步骤（3)制得的粗酶液用截留分子量为8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩 10倍，进液压控制在0. 15MPa以内，回流压控制在0. 1MPa以内。
[0034] (5)S/D法病毒灭活
[0035] 向步骤⑷超滤浓缩后的粗酶液中，分别加入终浓度为0.3% (w/v，即3g/L)的磷 酸三丁酯，终浓度为1% (w/v，S卩10g/L)的TritonX-100,搅拌均匀后，于24°C下保温8hr， 进行病毒灭活。
[0036] (6)凝血酶纯化
[0037] 将步骤（5)病毒灭活后的粗酶液上DEAE-SepharoseFastFlow层析柱，层析柱预 先用0.02!11〇1/1?8，？!17.9缓冲液平衡，上样完毕后，用该平衡液流洗至基线走平，再用含 0· 2mol/LNaCl的0· 02mol/LPB，pH7. 9缓冲液洗脱，收集目的峰，即得猪凝血酶。
[0038] 2、猪凝血酶冻干粉的制备
[0039] 于步骤1制备的猪凝血酶中，加入终浓度为1. 5% (w/v，即15g/L)的甘露醇，经除 菌过滤后，分装，冻干，真空压塞，乳铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；置于l〇〇°C干热处 理120min后，包装，即得猪凝血酶冻干粉制剂成品。
[0040] 实施例2本发明猪凝血酶冻干粉制剂的制备
[0041] 如图1所示示意图，制备本发明猪凝血酶冻干粉制剂。
[0042] 1、猪凝血酶的制备
[0043] (1)凝血酶原的制备
[0044] 取抗凝猪血浆35L;另取QAE-S印hadexA50凝胶干粉52. 5g，用3. 75mmol/L Na2B407-85mmol/LΗ3Β03,pH8. 0缓冲液溶胀，并平衡好后，加入至该血浆中，室温搅拌吸附 2hr;用双层400目绸布过滤收集上述吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱；先用纯化水 流洗至基线走平，再用0.lmol/LNaCl流洗至基线走平，最后用0. 4mol/LNaCl-2mmol/L BaCV冼脱，收集洗脱峰，得凝血酶原溶液7500mL。
[0045] (2)凝血活酶溶液的制备
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