专利名称：hfg12凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因合成或扩增构建基因产品的方法，具体涉及hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法及应用。
背景技术：
由于病毒性肝炎发病率高、危害性大，且无确定有效的治疗方法，已成为严重影响我国人民健康与生活水平、制约经济发展的重要疾病。
用鼠肝炎3型病毒(murine hepatitis virus-3，MHV-3)感染不同种系近亲繁殖小鼠，我们已成功建立了类似人类各种不同临床类型的肝炎模型，包括暴发型肝炎、慢性肝炎及临床健康病毒携带者(专利申请号02115980.7)；MHV-3诱导产生的鼠fgl2(mfgl2)凝血酶原酶(纤维介素)基因在鼠病变肝组织中选择性高度表达，其基因表达水平与肝组织纤维蛋白沉积及广泛肝细胞坏死密切相关；MHV-3感染小鼠接受鼠fgl2凝血酶原酶中和抗体注射后可减轻肝脏疾病严重程度并显著降低死亡率。以上结果表明，鼠fgl2凝血酶原酶在鼠暴发型肝炎的发病过程中起重要作用。
在上述研究的基础上，我们进一步发现暴发型乙型肝炎或重症乙型肝炎病人的肝脏组织的枯否氏细胞、血管内皮细胞和坏死、纤维化区域发现人fgl2(hfgl2)凝血酶原酶高度表达，说明人fgl2凝血酶原酶在人病毒性肝炎的恶化进展中起着关键的作用。
目前尚未有文献报道上述针对重症肝炎发病机制、阻断其病理衍变过程的基因治疗手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法及将构建的hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的应用。
我们的研究发现MHV-3可诱导鼠巨噬细胞产生炎性介质鼠fgl2凝血酶原酶，它在鼠暴发型肝炎的发病过程中起重要作用。另外，采用免疫组化和原位杂交技术对暴发型和慢性迁延型乙肝患者和正常对照者肝脏标本进行了研究，结果表明暴发型病毒性肝炎病人肝脏组织中枯否氏细胞、微血管内皮细胞和坏死、纤维化区域均高表达人fgl2凝血酶原酶，而慢性迁延型乙肝患者和正常对照者的肝组织未见人fgl2凝血酶原酶表达，表明人fgl2凝血酶原酶在人类病毒性肝炎的恶化进展中起着关键的作用。小鼠fgl2凝血酶原酶(mfgl2)和人fgl2凝血酶原酶(hfgl2)的基因序列已被鉴定测出。
本发明方法是根据hfgl2凝血酶原酶的mRNA或cDNA序列合成或扩增产生dsRNA或ASON的基因模板，将模板插入一个基因表达的载体中形成的。
将构建出的产品用于病毒性肝炎或急性移植排斥反应等的治疗。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是dsRNA以一种基因转录后沉寂(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的方式对同源基因表达进行干扰的过程，是自然界普遍存在的一种现象。RNA干扰也被称为转录后基因沉寂，是指外源核酸分子导入细胞诱导机体产生序列特异性的基因沉寂。这种沉寂最终均通过dsRNA作用于mRNA或其它可转录的RNA的方式对基因表达进行干扰。这种沉寂作用具有高效性。dsRNA可以作为基因组功能研究和基因抑制的有用工具。基于此，针对重症型肝炎发展中的关键炎性介质——fgl2凝血酶原酶，我们构建了其同源dsRNA，利用dsRNA的转录后沉寂作用，抑制fgl2凝血酶原酶的表达。RNA干扰主要是通过特定dsRNA作用于靶基因mRNA使其降解这一环节来实现对靶基因表达的干扰，该特定dsRNA的意义链序列与靶基因mRNA的某一段序列是完全一致的，该特定dsRNA长度仅需19nt就足以有效引起靶基因表达沉寂。
ASON是根据核酸杂交原理设计的，它能选择性地与靶基因特定功能位置结合(杂交)，抑制该基因表达，而不影响宿主正常功能。自从80年代初由Izant和Weitraub首次报道胸腺嘧啶激酶(TK)基因反义RNA能选择性抑制真核细胞TK基因表达以来，反义RNA作为一种调控特定基因表达的手段已被广泛采用。反义RNA分子与特异RNA分子互补结合，特异性封闭某些基因使其不表达或低表达，从而影响细胞的代谢活性及功能，因此具有潜在的药用价值。基于此，我们构建了针对hfgl2凝血酶原酶的ASON，使其在基因水平下调fgl2凝血酶原酶的表达。
图1构建hfgl2凝血酶原酶双链RNA载体2构建hfgl2凝血酶原酶反义寡核苷酸载体图具体实施方式
实施例1hfgl2凝血酶原酶双链RNA的构建1、构建产生hfgl2凝血酶原酶的dsRNA的短链dsDNA模板化学合成两条互补的74nt长的单链DNA5’-GGCAGCCAAGCTTGGAAATCGTAAATAGTCTATTCAAGAGATAGACTATTTACGATTTCC TTTTTATCGATTAC-3’3’-CCGTCGGTTCGAACCTTTAGCATTTATCAGATAAGTTCTCTATCTGATAAATGCTAAAGG AAAAATAGCTAATG-5’其中一条为模板链，可转录出具有反向重复序列的短链mRNA，该短链mRNA可形成发夹状双链RNA(dsRNA)，双链部分长19nt，双链中的一条链的序列与hfgl2凝血酶原酶mRNA序列的某一段完全一致。得到两条互补的74nt长的单链DNA后，以等摩尔混合退火生成dsDNA，该双链DNA两端有酶切位点。
2、将第1步中生成的模板dsDNA插入到pMSCVneo载体Neor基因下游的相应位点，如图1所示，选择Neor基因下游的多克隆位点作为外来基因插入部位。以缓冲液K(200mM Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)pH8.5，100mM MgCl2(氯化镁)，10mM Dithiothretol(二硫苏糖醇)，1000mM KCl(氯化钾))为双酶切缓冲液。
3、获得U6启动子U6启动子来自鼠基因组，我们首先从小鼠肝脏提取基因组DNA，使用软件Primer设计出U6启动子序列上下游的引物，PCR扩增出U6启动子。
4、将U6启动子插入到已插入dsDNA模板的pMSCVneo载体Neor基因下游相应酶切位点之间，正好位于dsDNA模板的上游，以缓冲液K(200mMTris-HCL(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)pH8.5，100mM MgCl2(氯化镁)，10mM Dithiothretol(二硫苏糖醇)，1000mM KCl(氯化钾))为双酶切缓冲液。即构建成产生hfgl2 dsRNA的表达体系。
应用将上述构建成功的dsRNA的表达体系导入细胞中后，产生发夹状dsRNA，双链部分长19nt， 该发夹状dsRNA可特异结合到细胞内hfgl2基因的mRNA上的特定位点，使其降解，干扰hfgl2的mRNA翻译生成凝血酶原酶的过程。
实施例2hfgl2凝血酶原酶反义寡核苷酸的构建1、根据fgl2凝血酶原酶cDNA序列，用软件Primer设计出hfgl2基因的部分外显子1(430nt)上下游的引物，通过PCR从含有hfgl2凝血酶原酶的mRNAcDNA的载体pCDNA3.1(自备)(如图2)扩增出部分外显子1
-19GGTGAGCAGCACTGT AAAGATGAAG CTGGCTAACT GGTACTGGCT GAGCTCAGCT GTTCTTGCCACTTACGGTTT TTTGGTTGTG GCAAACAATG AAACAGAGGA AATTAAAGAT GAAAGAGCAA AGGATGTCTG CCCAGTGAGACTAGAAAGCA GAGGGAAATG CGAAGAGGCA GGGGAGTGCC CCTACCAGGT AAGCCTGCCC CCCTTGACTA TTCAGCTCCCGAAGCAATTC AGCAGGATCG AGGAGGTGTT CAAAGAAGTC CAAAACCTCA AGGAAATCGT AAATAGTCTA AAGAAATCTTGCCAAGACTG CAAGCTGCAG GCTGATGACA ACGGAGACCC AGGCAGAAAC GGACTGTTGT TACCCAGTAC AGGAGCCCCGGGAGAGGTTG GTGATAACAG AGTTAGAGAA TTAGAGAGTG AGGTT+411部分外显子1序列两端引入酶切位点。
2、将扩增出的hfgl2凝血酶原酶基因的的部分外显子1反向插入pCR3.1载体相应酶切位点(见图2)，这样连接形成的载体在转染细胞内可转录出hfgl2基因的部分外显子1的反义RNA，即构建成产生hfgl2 ASON的表达体系。
应用将构建成的产生hfgl2 ASON的表达体系导入细胞后，可转录出hfgl2基因部分外显子1的ASON3′CCACU CGUCGUGACA UUUCUACUUC GACCGAUUGA CCAUGACCGA CUCGAGUCGA CAAGAACGGUGAAUGCCAAA AAACCAACAC CGUUUGUUAC UUUGUCUCCU UUAAUUUCUA CUUUCUCGUU UCCUACAGACGGGUCACUCU GAUCUUUCGU CUCCCUUuAC GCUUCUCCGU CCCCUCACGG GGAUGGUCCA UUCGGACGGGGGGAACUGAU AAGUCGAGGG CUUCGUUAAG UCGUCCUAGC UCCUCCACAA GUUUCUUCAG GUUUUGGAGUUCCUUUAGCA UUUAUCAGAU UUCUUUAGAA CGGUUCUGAC GUUCGACGUC CGACUACUGU UGCCUCUGGGUCCGUCUUUG CCUGACAACA AUGGGUCAUG UCCUCGGGGC CCUCUCCAAC CACUAUUGUC UCAAUCUCUUAAUCUCUCAC UCCAA5′此序列为ASON表达体系导入细胞后，转录产生的ASON序列，可根据碱基互补原则特异结合到hfgl2基因的mRNA的特定位点，干扰hfgl2的mRNA翻译生成凝血酶原酶的过程。
权利要求
1.一种hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于它是根据hfgl2的mRNA或cDNA序列合成或扩增产生dsRNA或ASON的基因模板，将模板插入一个基因表达的载体中形成的。
2.如权利要求1所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于所述化学合成的是两条互补的74nt长的单链DNA5’-GGCAGCCAAGCTTGGAAATCGTAAATAGTCTATTCAAGAGATAGACTATTTACGATTTCC TTTTTATCGATTAC-3’3’-CCGTCGGTTCGAACCTTTAGCATTTATCAGATAAGTTCTCTATCTGATAAATGCTAAAGG AAAAATAGCTAATG-5’其中一条为模板链，可转录出具有反向重复序列的短链mRNA，该短链mRNA可形成发夹状双链RNA即dsRNA，此双链中的一条链的序列与hfgl2凝血酶原酶mRNA序列的某一段完全一致，得到两条互补的74nt长的单链DNA后，以等摩尔混合退火生成dsDNA，该双链DNA两端有酶切位点，形成产生dsRNA的模板。
3.如权利要求1所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于所述扩增的出部分外显子1的DNA序列为-19GGTGAGCAGCACTGT AAAGATGAAG CTGGCTAACT GGTACTGGCT GAGCTCAGCT GTTCTTGCCACTTACGGTTT TTTGGTTGTG GCAAACAATG AAACAGAGGA AATTAAAGAT GAAAGAGCAA AGGATGTCTG CCCAGTGAGACTAGAAAGCA GAGGGAAATG CGAAGAGGCA GGGGAGTGCC CCTACCAGGT AAGCCTGCCC CCCTTGACTA TTCAGCTCCCGAAGCAATTC AGCAGGATCG AGGAGGTGTT CAAAGAAGTC CAAAACCTCA AGGAAATCGT AAATAGTCTA AAGAAATCTTGCCAAGACTG CAAGCTGCAG GCTGATGACA ACGGAGACCC AGGCAGAAAC GGACTGTTGT TACCCAGTAC AGGAGCCCCGGGAGAGGTTG GTGATAACAG AGTTAGAGAA TTAGAGAGTG AGGTT+411该序列为hfgl2基因的部分外显子1的序列，将部分外显子1两端引入酶切位点，形成ASON模板。
4.如权利要求2所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于将dsRNA模板插入到pMSCVneo载体Neor基因下游的相应位点，采用缓冲液K为双酶切缓冲；产生U6启动子，将U6启动子插入到已插入dsDNA模板的pMSCVneo载体，Neor基因下游相应酶切位点之间，正好位于dsDNA模板的上游，采用缓冲液K为双酶切缓冲液。
5.如权利要求4所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于从小鼠肝脏提取基因组DNA，使用软件Primer设计出U6启动子序列上下游的引物，PCR扩增出U6启动子。
6.如权利要求4所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于选择Neor基因下游的多克隆位点作为外来基因插入部位。
7.如权利要求3所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于所述扩增是根据hfgl2凝血酶原酶cDNA序列，用软件Primer设计出hfgl2基因的部分外显子1上下游的引物，通过PCR从含有hfgl2凝血酶原酶的mRNAcDNA的载体pCDNA3.1扩增出部分外显子1。
8.如权利要求3所述hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法，其特征在于所述插入是将将扩增出的hfgl2凝血酶原酶基因的部分外显子1反向插入pCR3.1载体相应酶切位点，这样连接形成的载体在转染细胞内可转录出hfgl2基因的部分外显子1的反义寡核苷酸。
9.一种hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的应用，其特征在于将hfgl2凝血原酶的双链RNA和反义寡核苷酸单独或联合使用，用于病毒性肝炎或急性移植排斥反应等的治疗。
全文摘要
本发明公开了一种hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的构建方法及将构建的hfgl2凝血酶原酶双链RNA和反义寡核苷酸的应用。它是根据hfgl2凝血酶原酶的mRNA或cDNA序列合成或扩增产生dsRNA或ASON的基因模板，将模板插入一个基因表达的载体中形成的。将构建出的产品用于病毒性肝炎或急性移植排斥反应等的治疗。
文档编号A61P37/06GK1510144SQ02154138
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月26日 优先权日2002年12月26日
发明者琴 宁, 宁琴, 罗小平, 汪之沫, 习东, 严伟明, 朱传龙 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院