取兔脑粉4g，加入80mL预热至45°C的生理盐水，于50°C水浴中搅拌提取15分钟 后，2000转/分钟离心5分钟，收集上清液即得凝血活酶溶液。
[0047] (3)凝血酶原激活
[0048] 于步骤（1)制备的凝血酶原溶液中加入35mL步骤⑵制备的凝血活酶溶液 和10. 5g无水氯化钙，搅拌均匀后，于31°C水浴中静置激活lhr;将激活后的粗酶液于 4°C5000rpm离心lOmin，用双层400目绸布过滤收集上清液，即得凝血酶粗酶液。
[0049] (4)超滤脱盐并浓缩粗酶液
[0050] 将步骤（3)制得的粗酶液用截留分子量为8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩 20倍，进液压控制在0. 15MPa以内，回流压控制在0. 1MPa以内。
[0051] (5)S/D法病毒灭活
[0052] 向步骤（4)超滤浓缩后的粗酶液中，分别加入终浓度为0.3% (w/v，即3g/L)的磷 酸三丁酯，终浓度为1 % (w/v，即10g/L)的吐温-80,搅拌均匀后，于26°C下保温6hr，进行 病毒灭活。
[0053] (6)凝血酶纯化
[0054] 将步骤（5)病毒灭活后的粗酶液上DEAE-SepharoseFastFlow层析柱，层析柱预 先0. 05mol/LTris-HCl，pH8. 0缓冲液平衡，上样完毕后，用该平衡液流洗至基线走平，再用 含0· 2mol/LNaCl的0· 05mol/LTris-HCl，pH8. 0缓冲液洗脱，收集目的峰，即得猪凝血酶。
[0055] 2、猪凝血酶冻干粉的制备
[0056] 于步骤1制备的猪凝血酶中，加入终浓度为3. 5% (w/v，即35g/L)的右旋糖酐40， 经除菌过滤后，分装，冻干，真空压塞，乳铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；置于100°C干 热处理30min后，包装，即得猪凝血酶冻干粉制剂成品。
[0057] 实施例3猪凝血酶纯化效果评价
[0058] 取抗凝猪血浆35L，采用实施例2工艺方法提取、分离纯化猪凝血酶，连续重复三 次，综合评价凝血酶纯化效果、产率和S/D残留量等工艺指标和质量指标。实验结果见表1。
[0059] 表1猪凝血酶纯化效果评价实验结果
[0060]
[0061]根据表1结果可知，凝血酶经两步层析后，比活性可达130U/mg以上，高于国家药 典标准（10U/mg)l个数量级；每升猪血浆可产得80000U以上的凝血酶纯品，且其中的吐 温-80 (Tween-80)和磷酸三丁酯（TNBP)残留量均符合国家标准（Tween-80 < 100μg/mL， TNBP< 10μg/mL)。而且整个纯化过程使用到的缓冲液均为简单、普通、价廉的无机试剂， 生产放大容易，成本低，适合于工业化生产。
[0062] 实施例4猪凝血酶冻干粉制剂处方及干热灭活工艺参数影响
[0063] 按实施例2工艺方法提取、分离纯化猪凝血酶，分别按不同制剂处方制成冻干粉 (灌装量为2mL/支，制剂规格为1000U/支），均于100°C干热灭活2hr，并于Omin(未处理）、 30min、60min、120min取样，按《中国药典》三部方法检测制品效价。实验结果见表2。
[0064] 表2猪凝血酶冻干粉干热法处理样品活性变化（100°C，2hr)
[0065]
[0067] 从表2中可看出，随着右旋糖酐40或甘露醇浓度升高，猪凝血酶冻干粉制剂耐热 性更强。综合考虑成本因素，制剂处方中右旋糖酐40或甘露醇浓度以2.5% (w/v，即25g/ U为最佳。
[0068] 实施例5猪凝血酶冻干粉干热法对猪细小病毒的灭活效果验证
[0069] 猪细小病毒（PPV，基础滴度7. 5LgTCID5Q/0.lmL)，病毒检测用细胞：IBRS2细胞，以 及样品病毒滴度的检测，均由华中农业大学动物医学院提供。
[0070] 按实施例2工艺方法制备猪凝血酶，按"500U/mL凝血酶，2. 5% (w/v，即25g/L)甘 露醇"的制剂处方配制半成品。取该半成品36mL，加入4mL猪细小病毒液，混匀，按2. 22mL/ 支分装于西林瓶中，半加塞；冻干后，全加塞，乳铝塑组合盖；于100°C干热灭活2hr，并于 Omin(未处理）、30min、60min、120min取样，检测病毒滴度。重复实验三次。实验结果见表 3〇
[0071] 表3干热法对猪凝血酶冻干粉中PPV灭活效果（100°C2hr，单位：LgTCID5Q/0.lmL)
[0072]
[0073] 注：实验最低检测限为0· 50LogTCID5Q/0.lmL。
[0074] 从表3中可看出，经100°C干热30min，即可使猪凝血酶冻干粉中的猪细小病毒下 降大于41ogs;干热60min后，病毒滴度降至检测限以下。因此，本发明工艺对最终成品进 行干热灭活处理，可有效灭活制品中潜在的猪源性病毒污染，进一步提高了制品安全性。同 时因是对终产品进行病毒灭活，可防止出现加热灭活后再污染，方法简单，易于实施。
[0075] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： ⑴抗凝猪血浆与经过含有Na2B4073. 75mmol/L和H3B0385mmol/L且pH值为8. 0的硼 酸-硼砂缓冲液平衡的QAE-S印hadexA50凝胶按照1L: 1~1. 5g的用量混合，室温搅拌吸 附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗至基 线走平，再用〇.lmol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0. 4mol/L的NaCl和2mmol/L的 BaCl2的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液； (2) 按兔脑粉与生理盐水为lg: 20mL的比例，向兔脑粉中加入45°C的生理盐水，保持 45~50°C搅拌提取15~20分钟后，2000rpm离心5分钟，收集上清液；按照上清液：凝血 酶原溶液：CaCl2= 4. 7mL: 1L: 1. 4g的用量进行配比混合搅拌均匀后，于25~31°C水浴中 静置激活1~2hr进行酶原激活，然后于4°C5000rpm离心lOmin，用双层400目绸布过滤， 收集上清得凝血酶粗酶液； (3) 凝血酶粗酶液用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩10~20倍，进 液压控制在0. 15MPa以内，回流压控制在0.IMPa以内，浓缩后的粗酶液中加入病毒灭活剂 搅拌均匀后，于24~26°C下保温6~8hr，进行病毒灭活；所述病毒灭活剂包括终浓度3g/ L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的吐温-80 ;或者所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸 三丁酯和终浓度l〇g/L的TritonX-100〇 (4)灭活病毒后的粗酶液过DEAE-S印harose Fast Flow层析柱，先用平衡液流洗至基 线走平后，用洗脱液洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶； (5) 步骤（4)所得猪凝血酶加入终浓度为15~35g/L的甘露醇或右旋糖酐40,过滤除 菌，分装，冻干，真空压塞，乳铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品； (6) 猪凝血酶冻干品在100°C下进行干热处理30~120min以再次灭活病毒，然后进行 包装，即得猪凝血酶冻干粉。2. 根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（4)中所述平 衡液为pH值7. 9且浓度为0· 02mol/L的PB缓冲液，洗脱液为pH值7. 9,且含0· 2mol/LNaCl 的浓度为〇· 〇2mol/L的PB缓冲液。3. 根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（4)中，平衡 液为pH值8. 0且浓度为0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为pH值8. 0,且含0· 2mol/ L NaCl的浓度为0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液。4. 根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤（5)中，甘露 醇或右旋糖酐40的终浓度为25g/L。5. 根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，干热 处理时间为60min。6. 权利要求1~5任一所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法获得的产品。
【专利摘要】本发明公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：抗凝猪血浆与凝胶混合搅拌吸附，过柱洗脱获得凝血酶原溶液；向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl2进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过DEAE-Sepharose？Fast？Flow层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；猪凝血酶加入甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；冻干品在100℃下进行干热处理以再次灭活病毒，包装即得猪凝血酶冻干粉。产品中猪凝血酶比活性不低于130U/mg，整个工艺步骤简单、易实施，提高了制品安全性，适合于工业化生产。
【IPC分类】A61K38/48, C12N9/74, A61P7/04, A61K9/19
【公开号】CN105250226
【申请号】CN201510638083
【发明人】汤华东, 吴红梅, 朱德芳, 陈亚, 陈煌
【申请人】武汉海特生物制药股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月30日