专利名称：检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板法的制作方法
技术领域：
本发明属生物蛋白酶特别是凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂检测方法领域。
背景技术：
凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂(如水蛭素、肝素)等广泛存在于动、植物中，是医学、生物工程学及生物制药的主要研究对象。对凝血酶、类凝血酶及其抑制剂进行生物活性测定是科学研究与工业生产的必备条件。目前已建立的生物活性检测方法主要有两种凝血酶滴定法和凝血酶显色底物法。凝血酶滴定法因其操作较为简便、快速，应用最为广泛。但存在用肉眼判断凝固点(即反应终点)的差异大、检品的浊度或颜色相互干扰、敏感度低(检测到每毫升10酶活力单位)、定量不准确等问题。在有了人工合成的显色底物后，用凝血酶显色底物法实现了凝血酶的定量检测，其敏感度大为提高(检测到每毫升2.5酶活力单位)；但由于显色底物试剂过于昂贵，测定时设备条件要求较高，检品浊度或颜色也易受干扰，使其应用受到限制。这对凝血酶、凝血酶抑制剂、类凝血酶(蛇毒降纤酶)等方面的深入研究与开发利用带来一定难度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种定量检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂生物活性的简便、稳定、高敏感度、低成本的检测方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题采用纤维蛋白原平板法定量检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂生物活性，方法是一、制板将加热充分溶解的琼脂糖和用0.1M pH7.4磷酸缓冲液溶解的纤维蛋白原，以重量比容积为1∶1的比例混合，在平皿中灌板，冷却后即制成纤维蛋白原琼脂平板。
二、打孔纤维蛋白原琼脂平板冷却后，按一定间距打孔。
三、标准品、检品的准备及加样反应用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成系列浓度。用同样的缓冲液溶解检品并作适当稀释。将稀释后的标准品、检品分别在上述板孔中加样。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应7-10小时。
四、测量反应孔沉淀圈，绘制标准曲线，计算结果在纤维蛋白原琼脂平板加样扩散反应后，可肉眼看到加样孔由内向外形成乳白色圆形沉淀圈，沉淀圈的大小与酶活力浓度成正相关。测量各标准品反应孔沉淀圈直径，在半对数坐标纸上绘制酶活力单位标准曲线。测量各检品反应孔沉淀圈直径，即可在标准曲线上查出其酶活力单位数，乘以检品的稀释倍数即为检品的实际酶活力单位数。
本发明的检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板法，操作简便、直观、稳定、敏感度高(检测到每毫升0.15酶活力单位)，不受检品浊度或颜色干扰，成本低廉。在普通实验室中只要有恒温箱即可实施，是一种易于推广使用的实验方法。
图1为进行类凝血酶检测用的纤维蛋白原平板的照片。
图2是实施例1的标准曲线图。
图3是实施例2的标准曲线图。
图4是实施例3的标准曲线图。
图5是实施例4的标准曲线图。
具体实施例方式
本发明主要是利用纤维蛋白原为底物，使用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原琼脂平板，通过标准品及检品在该平板上的扩散反应，对凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂进行定量检测。其基本原理在于将酶的底物—纤维蛋白原均匀地固定于琼脂平板上，通过向样孔内加入酶溶液进行扩散反应，酶在扩散过程中与底物发生水解反应，使纤维蛋白原水解成纤维蛋白，并发生交联呈乳白色沉淀。白色沉淀圈大小与酶活力呈正相关。将已知活力单位的凝血酶、类凝血酶标准品稀释成系列浓度及待检样品适当稀释，在纤维蛋白原平板进行扩散反应，通过测量反应孔沉淀圈大小即可绘制出相应的酶活力标准曲线。同时测量在相同条件下检品反应孔沉淀圈大小，即可在标准曲线上查出对应值而达到定量检测的目的。
检测凝血酶和类凝血酶的主要步骤是一、制作纤维蛋白原琼脂平板(1)配制重量百分比(以下同)为2.5％琼脂糖，加热充分溶解。
(2)纤维蛋白原用0.1M pH7.4磷酸缓冲液溶解，与上述琼脂糖(加热至90～100℃)以重量比容积为1∶1的比例混合，在平皿中灌板，灌板厚度约为2毫米，冷却后即制成纤维蛋白原琼脂平板。
二、打孔在冷却凝固的纤维蛋白原琼脂平板上，按1.6厘米的间距打孔。孔径约为4毫米。
三、标准品、检品的准备及加样反应用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成系列浓度。用同样的缓冲液溶解检品并根据不同要求作适当稀释。将稀释后的标准品、检品分别在上述纤维蛋白原琼脂平板板孔中加样，每孔加样18μl。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应7-10小时。
四、绘制标准曲线、计算结果在纤维蛋白原琼脂平板加样扩散反应后，测量各标准品反应孔沉淀圈直径(毫米)，在半对数座标纸上绘制酶活力标准曲线。测量各检品反应孔沉淀圈直径，即可在标准曲线上查出其相应的酶活力单位，乘以检品的稀释倍数即为检品的实际酶活性单位数。
凝血酶抑制剂-水蛭素的活性的定量检测步骤是将水蛭素检品用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解，作2倍、4倍、8倍、16倍稀释。用2.5U/ml凝血酶标准品以1∶1的比例分别与上述稀释的水蛭素混合(此时混合后水蛭素的稀释倍数应为4倍、8倍、16倍、32倍，凝血酶浓度应为1.25U/ml)，置37℃反应5分钟，即可与各稀释浓度的凝血酶标准品在纤维蛋白原琼脂平板上分别加样，每孔加样18μl，平皿加盖后置37℃恒温扩散反应7-10小时。根据扩散反应制作标准曲线，测量水蛭素检品孔，即可在标准曲线上查出各孔凝血酶的剩余单位数。水蛭素的生物活性是用抑制一个活性单位的凝血酶的量来表示水蛭素一个抗凝血酶单位(ATU)。用参加反应的凝血酶(1.25U/ml)的量与反应后凝血酶的剩余量相减，再乘上水蛭稀释倍数，即可计算出水蛭素检品的实际活性单位。
实施例1凝血酶的定量检测①配制2.5％琼脂糖称取2.5克琼脂糖，置烧瓶中，加入蒸馏水至100ml，置100℃水浴约30分钟，使琼脂糖充分溶解备用。
②现配0.1％(百分比浓度，以下同)纤维蛋白原缓冲液称取人纤维蛋白原8mg，用0.1M pH7.4磷酸缓冲液8ml溶解。
③制板取直径为9厘米的平皿，放置水平的台面上(用水平尺测量)。将配制好的2.5％琼脂糖加热至90～100℃，取8ml与0.1％纤维蛋白原缓冲液8ml混匀，立即倒入平皿中，室温冷却后即为纤维蛋白原平板。
④打孔在冷却后的纤维蛋白原琼脂平板上，按1.6厘米的间距打孔。孔径为4毫米。
⑤标准品及检品的准备及加样反应用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成5.0U/ml、2.5U/ml、1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml系列浓度。用同样的缓冲液1ml溶解检品，并作20倍、40倍、80倍稀释。将稀释后的标准品、检品分别在上述板孔中加样，每孔加样18μl。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应9小时。
⑥绘制标准曲线、计算结果使用油标卡尺测量各反应孔沉淀圈直径(mm)大小；标准孔按5→0.15U/ml的顺序，沉淀圈直径依次为11.12mm，10.06mm，9.22mm，8.26mm，7.30mm，6.36mm；检品孔取落在标准曲线中间的检品孔进行计算，稀释80倍为8.98mm，在下述标准曲线上查出的酶活性为1.07U/ml，乘上检品的稀释倍数80，检品的实际酶活性为85.6单位/ml。
实施例2凝血酶的定量检测步骤①～④同实施例1。
⑤标准品及检品的准备及加样反应用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成5.0U/ml、2.5U/ml、1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml系列浓度。用同样的缓冲液1ml溶解检品，并作160倍稀释。将稀释后的标准品、检品分别在上述板孔中加样，每孔加样18μl。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应7小时。
⑥绘制标准曲线，计算结果使用油标卡尺测量各反应孔沉淀圈直径大小，标准孔按5→0.15U/ml的顺序，沉淀圈直径依次为7.94mm，7.62mm，7.20mm，6.78mm，6.24mm，5.94mm；检品孔稀释160倍为6.36mm，在下述标准曲线上检出的酶活性为0.32U/ml，乘上检品的稀释倍数160，检品的实际酶活性为51.2U/ml。
实施例3类凝血酶的定量检测①同实施例1。
②现配0.15％纤维蛋白原缓冲液称取人纤维蛋白原12mg，用0.1M pH7.4磷酸缓冲液8ml溶解。
③制板取直径为9厘米的平皿，放置水平的台面上(用水平尺测量)。将配制好的2.5％琼脂糖加热至90～100℃，取8ml与0.15％纤维蛋白原缓冲液8ml混匀，立即倒入平皿中，室温冷却后即为纤维蛋白原平板。
④打孔同实施例1。
⑤标准品及检品的准备及加样反应用0.05M PH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml、0.075U/ml系列浓度。用同样的缓冲液1ml溶解检品，并作10倍稀释。将稀释后的标准品、检品分别在上述板孔中加样，每孔加样18μl。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应10小时。
⑥绘制标准曲线，计算结果使用油标卡尺测量各反应孔沉淀圈直径大小；标准孔按1.25→0.075U/ml的顺序，沉淀圈直径依次为12.28mm，10.9mm，9.52mm，8.04mm，6.56mm；检品孔稀释10倍为10.68mm，在下述标准曲线上检出的酶活性为0.56U/ml，乘上检品的稀释倍数10，检品的实际酶活性为5.6U/ml。
实施例4凝血酶抑制剂生物活性的定量检测制板、打孔同实施例1的①～④；标准品及检品的准备及加样反应凝血酶标准品系列浓度稀释同实施例1的⑤，水蛭素检品用0.05M pH7.4磷酸缓冲液1ml溶解，作2倍、4倍、8倍、16倍稀释。用稀释好的2.5U/ml凝血酶标准品按1∶1的比例分别与上述稀释的水蛭素混合(此时混合后水蛭素的稀释倍数应为4倍、8倍、16倍、32倍，凝血酶浓度应为1.25U/ml)，置37℃反应5分钟，即可在纤维蛋白原琼脂平板上与标准品同时加样，每孔加样18μl，平皿加盖后置37℃恒温扩散反应8小时。
绘制标准曲线，计算结果使用油标卡尺测量各反应孔沉淀圈直径大小；标准孔按5→0.15U/ml的顺序，沉淀圈直径依次为10.88mm，9.74mm，8.88mm，7.8mm，6.90mm，6.48mm；检品孔取落在标准曲线中间的检品孔进行计算，稀释16倍为8.18mm，在下述标准曲线上查出凝血酶的剩余单位数为0.7U/ml，被水蛭素抑制的凝血酶的量应为1.25U/ml-0.7U/ml＝0.55ATU/ml。再乘上水蛭稀释倍数，水蛭素检品的实际为8.8ATU/ml。
权利要求
1.一种检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板方法，利用纤维蛋白原为底物，其特征是步骤为a.制板将加热充分溶解的琼脂糖和用0.1M pH7.4磷酸缓冲液溶解的纤维蛋白原，以重量比容积为1∶1的比例混合，在平皿中灌板，冷却后即制成纤维蛋白原琼脂平板；b.打孔纤维蛋白原琼脂平板冷却后，按一定间距打孔；c.标准品、检品的准备及加样反应用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解标准品，并稀释成系列浓度；用同样的缓冲液溶解检品并作适当稀释；将稀释后的标准品、检品分别在上述板孔中加样。平皿加盖后置37℃恒温扩散反应7-10小时；d.测量反应孔沉淀圈，绘制标准曲线，计算结果在纤维蛋白原琼脂平板加样扩散反应后，可肉眼看到加样孔由内向外形成乳白色圆形沉淀圈，沉淀圈的大小与酶活力浓度成正相关；测量各标准品反应孔沉淀圈直径，在半对数坐标纸上绘制酶活力单位标准曲线；测量各检品反应孔沉淀圈直径，即可在标准曲线上查出其酶活力单位数，乘以检品的稀释倍数即为检品的实际酶活力单位数。
2.如权利要求书所述的检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板方法，其特征是凝血酶抑制剂-水蛭素的活性的定量检测步骤是将水蛭素检品用0.05M pH7.4磷酸缓冲液溶解，并作适当倍数稀释，凝血酶标准品以1∶1的比例分别与上述稀释后不同浓度的水蛭素混合稍置后，即与各稀释浓度的凝血酶标准品在纤维蛋白原琼脂平板上分别加样，恒温扩散反应；根据扩散反应制作标准曲线，测量水蛭素检品孔，即可在标准曲线上查出各孔凝血酶的剩余单位数；用参加反应的凝血酶的量与反应后凝血酶的剩余量相减，再乘上水蛭稀释倍数，即可计算出水蛭素检品的实际活性单位。
全文摘要
一种检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板方法，使用琼脂糖与纤维蛋白原制作成纤维蛋白原琼脂平板，通过标准品及检品在该平板上的扩散反应作定量检测。本发明的检测凝血酶、类凝血酶及凝血酶抑制剂的纤维蛋白原平板法，操作简便、直观、稳定、敏感度高(检测到每毫升0.15酶活力单位)，不受检品浊度或颜色干扰，成本低廉。在普通实验室中只要有恒温箱即可实施，是一种易于推广使用的实验方法。
文档编号C12Q1/56GK1763219SQ200510019588
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者廖共山, 班建东 申请人:广西医科大学