斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因与工程菌的制作方法

专利名称：斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因与工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因及其克隆，以及甜菜碱醛脱氢酶基因原核表达系统的构建，属于生物工程领域。
背景技术：
甜菜碱是一种季胺型水溶性生物碱，其化学名称为N-甲基代氨基酸，通式为R4·N·X。甜菜碱在许多动植物体内是一种甲基供体，具有促进动物蛋白质和脂肪代谢、缓和应激、调节渗透压、增进食欲、稳定维生素、参与预防球虫病、提高成活率和抗病率等作用，可作为饲料添加剂促进家畜生长，增进体重及产蛋量；甜菜碱在精细化工上，可作为生产有机胺的原料和保湿剂(其保湿性约为丙三醇的12倍，山梨醇的3倍)；甜菜碱具有温和的药理性质，参与脂肪代谢，改善线粒体中甘油三脂含量，清除肝内的多余脂肪，具有预防脂肪肝、肝硬化，使肝脏恢复健康的作用，还具有轻度降压作用；近年来研究发现甜菜碱做PCR反应缓冲液组分，可降低双螺旋DNA的稳定性，使二级结构易于打开；而且甜菜碱是多种高等植物体内一种重要的渗透条件物质，是被研究的150多种代谢物中最好的一种。甜菜碱在植物中的生理功能(1)参与细胞渗透调节作用，(2)参与稳定生物大分子的结构与功能，(3)影响离子在细胞中的分布。
专利申请号为97125830.9的发明专利“山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法”，介绍了山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因及其DNA序列，提供了将该基因转化到宿主植物并使之在其中表达的载体，同时还提供了转碱醛脱氢酶基因的植物以及使植物具有高耐盐性的方法。
专利申请号为01106076.X的发明专利“辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因及其克隆”，提供了碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA全序列及其相应的氨基酸序列及其植物表达载体，可用于植物的遗传转化提高植物抗逆性。
专利申请号为03153382.5的发明专利“红树甜菜碱醛脱氢酶基因提高植物耐盐性的方法”，公开了红树甜菜碱醛脱氢酶基因的碱基序列及其相应的氨基酸序列，构建了植物表达载体转导植物细胞，获得转基因后代。

发明内容
本发明的目的是编码一种来自于斑茅(Erianthusarundinaceus L.)的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的基因，以及构建含斑茅BADH基因的工程菌。
本发明的斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因，编码一种来自于斑茅BADH的基因、BADH基因cDNA全序列及其相应的氨基酸序列；由于斑茅具有较强的抗逆性和较高的甜菜碱含量，通过构建含斑茅BADH基因的工程菌，表达BADH蛋白，有利于进一步利用。
本发明的斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因，其序列为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列。
斑茅甜菜碱醛脱氢酶核苷酸序列推演的编码蛋白的氨基酸，其序列为序列表中SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
斑茅BADH基因克隆的方法如下1、主要试剂、仪器来源(1)工具酶和试剂盒限制性内切酶、Access RT-PCR System试剂盒购自Promega公司；Trizol试剂盒购自Gibico-BRL公司；Tag DNA聚合酶购自上海生工生物工程有限公司；Southern杂交试剂盒购自Clontech公司；PCR片段回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；(2)常用化学试剂硝酸纤维素膜购自Millipore公司；RNaseA购自北京华美生物工程公司；IPTG、X-Gal、等购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA Marker、dNTPs混合物、DEPC购自上海生物工程有限公司；其它试剂购自上海生工生物工程有限公司或国产分析纯试剂。
(3)主要仪器设备AB204N电子分析天平瑞士梅特勒公司；EPS 301电泳仪安发玛西亚公司；Ultrospec 2100型核酸蛋白测定仪瑞典APBiotech；生物安全柜上海力新有限公司；MasterCyclergradient 96PCR仪德国Eppendorf公司；BIO-PROFIL凝胶成像及分析系统法国VL公司；Model 400型杂交箱美国Robbin公司；UVC500紫外交联仪美国Hoefer公司；5810 R型台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；RC-5C PLUS落地式高速冷冻离心机美国Kendro公司；真空离心浓缩系统德国Eppendorf公司。
2、操作步骤(1)材料处理3个月斑茅幼苗，300mmol/LNaCl浇灌，3天后采叶。
(2)采用Trizol提取总RNA迅速采取盐胁迫植株叶片放于液氮中保存；液氮研磨0.5g叶片成粉末，迅速加入1ml Trizol试剂混匀；室温静止5min，12000g离心10min；取上清，加入0.2ml氯仿充分混匀，室温静止3min，4℃条件下11800g离心15min；小心移取上层液，加入-20℃欲冷的异丙醇中混匀，室温放置10min；11800g离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗两次，室温凉干，溶于适量DEPC处理水，-70℃保存备用。
(3)RT-PCR利用M-MLV进行反转录，用Taq Plus I DNA Polymerase来PCR扩增目的片段。基本步骤为取2μg RNA、1μg Poly A锚定引物，用适量DEPC处理水补足13μl，混匀、离心，70℃水浴5min，冰浴；然后加入提前混合的12μl混合物(M-MLV 5×反应缓冲液5μl、10μmol/L dNTP混合物5μl、rRNasin核糖核酸酶抑制物1μl，M-MLV1μl)，混匀离心，42℃水浴60min；72℃ 15min使反转录酶灭活；取2μl反转录产物进行RT-PCR，反应体系1倍PCR缓冲液，dNTP混合物0.15mmol/L，Tag酶1U，上下游引物分别为200nmol/L，cDNA 2μl，双蒸水补足，终体积为20μl。扩增条件94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸7minute 1个循环，4℃保存。
(4)目的基因3’端和5’端的获得参照SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit说明书进行。
目的基因3’端的PCR扩增以扩增部分目的片段的上游引物GSP1为引物(引物见图1，下同)，按照试剂盒说明书建立50μl PCR反应体系PCR-Grade Water 34.5μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 5μl，dNTP Mix(10mmol/L)1μl，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1μl，GSP1(10μmol/L)1μl，UPM 5μl，目的cDNA 2.5μl；PCR反映条件94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，2个循环；94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 3min，2个循环；94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 3min，2个循环，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 3min，4个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 3min，21个循环；保持4℃。
目的基因5’端的PCR扩增根据部分目的片段测序结果，设计三条5′RACE引物GSP3、GSP4、GSP5，由上海生物工程公司合成。由于目的基因5′端GC含量较高，因此使用TaKaRa的LA TagTM扩增目的基因的5′端。PCR反应体系为2×GC Buffer I 25μl，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)8μl，GSP3或GSP4或GSP5(10μmol/L)2μl，UPM(10μmol/L)2μl，TaKaRa LA Tag(5U/μL)0.5μl，灭菌双蒸水补足50μl。PCR反映条件94℃ 2min；94℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 2min，2个循环；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min，2个循环；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，5个循环，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 7min；保持4℃。
(5)斑茅BADH全基因的获得根据斑茅BADH基因5′端和3′端的测序结果，GenBank中blast分析结果，用OMIGA软件来预测其开放读码框，然后分别从起始密码子和终止密码子设计上下游引物，扩增BADH基因的开放读码区，结果见图2。以GSP6和GSP3的cDNA片段为探针，Southern杂交验证PCR产物正确性。
(6)目的片段回收琼脂糖凝胶电泳，用干净手术刀，在紫外照射尽量短时间内，割取尽量小胶块，放入事先称重离心管。参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书，回收目的片段。琼脂糖电泳检测回收片段质量，紫外分光光度计测定其浓度，备用。
(7)目的片段与载体连接参照pMD18-T vector说明书进行。
(8)阳性克隆鉴定从转化平皿上随机挑取白色菌斑，接种于含150μg/mL Amp的2ml LB中，37℃、200转培养过夜。用PCR和质粒酶切两种方法鉴定阳性克隆。
PCR鉴定取0.8μl菌液用高压双蒸水补足5μl，94℃ 10min，4℃保存备用；PCR反应体系1倍PCR缓冲液，dNTP混合物0.15mmol/L，Tag酶1U，上下游引物各200nmol/L，上述菌体裂解液，终体积为20μl。扩增条件94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸7min，1个循环；4℃保存。
酶切鉴定包括以下步骤●将1.5ml菌液移入微量离心管中，12000g离心5min；●去净上清，加入100μl溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)，剧烈震荡混匀；●加入新配制溶液II(0.2mol/L NaOH，1％ SDS)，快速颠倒离心管几次，确保离心管整个表面均匀与溶液II接触，不要震荡；●加入150μl溶液III(5mol/L乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml混合配置)，将离心管缓慢颠倒几次使之混匀，冰上放置3□5min；●4℃12000g离心5min；●转移上清液至一新离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，反复颠倒混匀，4℃ 12000g离心5min；●转移上清液至2倍体积无水乙醇中，混匀，室温静置2min；●4℃ 12000g离心5min，除净上清液；●加入75％乙醇洗两次，真空浓缩仪抽干；●用适量含胰RNA酶(20μg/mL)的TE(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/LEDTA，pH 8.0)溶解，-20℃保存；●限制性内切酶酶切反应体系1×RE Buffer，Acetylated BSA 0.1μg/μL，Plasmid DNA 10μg，Restriction Enzyme 5U，水补足20μl反应体积；●37℃酶切过夜，琼脂糖电泳检测。
(9)目的片段测序选取阳性克隆，委托上海生物工程公司测序，测序结果如SEQ ID NO1所示。
分析斑茅BADH基因序列，将斑茅BADH编码区1515bp核苷酸序列在GenBank中进行比较，其与Zea mays PCO110216的已知部分序列同源性为97％；与S.bicolor BADH1部分序列同源性为95％；与水稻BADH和H.vulgare BBD2完整编码区22bp以后同源性分别为83％和82％，其中150∽221bp和22bp以前无同源性；与T.aestivum的BADH从34bp后同源性为85％，其中34bp前和150∽221bp无同源性，也就是说其编码区的5′端特异；其与S.bicolour BADH15的cDNA部分片段同源性介于78％～91％；和H.vulgare BBD1的cDNA部分片段同源性介于81％∽89％。与拟南芥、油菜、甜菜、菠菜、碱蓬、红树林、几种滨藜属等植物的甜菜碱醛脱氢酶基因部分序列同源性在70％以上。
分析斑茅BADH核苷酸序列推演的氨基酸含有十肽Val-Thr-Leu-Geu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro，一个与酶功能有关的醛脱氢酶高度保守的序列，以及C-端信号肽Ser-Lys-Leu，无典型进入叶绿体的信号肽。
本发明克隆的斑茅BADH cDNA全长1718bp，5′端290bp左右片段GC含量较高，包含一个1515bp的开放读码框，5′端非编码区35bp，3′端非编码区165bp，poly(A)上游有一聚腺苷酸五碱基AATAA，起始密码子包含于序列CCGATGGC中，编码505个氨基酸，理论分子量为54.905kDa。本发明还可利用斑茅甜菜碱醛脱氢酶BADH基因的原核表达系统表达甜菜碱醛脱氢酶，制备抗体用于检测转化BADH基因的植物的BADH表达水平，通过诱导体系优化生产甜菜碱。
在SEQ ID NO1中描述的序列编码来自斑茅BADH，它能使斑茅植物具有较强的抗逆性和较高的甜菜碱含量，达到10.73mg/100gFW，高于其他植物(见表1)。利用上述序列在甘蔗等转基因植物中表达，也可以增加甘蔗植株的甜菜碱含量，提高甘蔗的抗逆性。
表1.各种植物甜菜碱的含量

2、构建斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌构建本发明含斑茅BADH基因的工程菌，以pET-29a(+)(美国CLONTECH公司商业购买)的质粒载体作为原始载体，利用限制性内切酶XhoI和Bgl II酶切斑茅BADH基因，同时用PCR扩增获得的含XhoI和Bgl II位点片段，用T4连接酶连接，利用大肠杆菌BL21菌株，(商业购买)遗传转化，经氨苄筛选，PCR检测和酶切鉴定，获得含斑茅BADH基因的工程菌菌株，命名为Escherichia coli，简称为pEBADH，已于2005年4月28日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.1362。
本发明构建含斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌的方法(见图3)，包括以下步骤(1)提取pET-29a(+)质粒DNA，同时用限制性内切酶XhoI和Bgl II酶切，酶切反应体系为10×RE Buffer 3μl，Acetylated BSA(10μg/μL)0.3μl，Plasmid DNA 10μg，Restriction Enzyme Xho I和Bgl II(5U/μL)各1μl，水补足30μl反应体积；37℃反应过夜；然后胶回收载体片段。
(2)根据斑茅BADH全基因的编码区、原核表达载体pET29a的多克隆位点和翻译蛋白移码问题，分别设计上下游引物GSP10、GSP11，GSP10引物5′端加Bgl II内切酶位点，GSP11引物5′端加Xho I内切酶位点。
(3)以斑茅BADH的质粒DNA为模板，PCR扩增目的片段，胶回收，取4μl，用Xbo I和Bgl II酶切。
(4)取酶切胶回收的载体1μl，目的片段酶切产物1μl，加入6μl水，混匀；65℃ 3min；冰上放置5min；再加入T4连接酶1μl和反应缓冲液1μl，室温2～3h；将连接液加入感受态细胞，42℃ 90s，冰上5min；最后将连接液加入450μl 37℃预热的LB中，轻摇30min，分别涂于事先制备有卡那抗性LB平皿，倒置，37℃培养12～16h。
(5)阳性克隆鉴定方法与斑茅BADH基因克隆方法中的操作步骤(8)相同，结果见图4。
本发明的含斑茅BADH基因的工程菌，其特征在于可以表达有活性的斑茅甜菜碱醛脱氢酶。试验证明，通过诱导体系优化，可以表达出斑茅的BADH蛋白，其BADH酶蛋白活性相当于原来斑茅中自身的BADH活性；而原始菌株经诱导无法表达出该酶蛋白，不存在BADH。纯化的BADH蛋白可以用于制备斑茅BADH多克隆抗体和单克隆抗体，用于转基因的WESTREN杂交；而且，经优化后也还可以用于生产甜菜碱。


图1BADH基因的克隆与工程菌构建引物表。
图2表示BADH编码区扩增结果。1为BADH编码区.M为分子量标记。
图3斑茅BADH原核表达重组质粒(pEBADH)构建过程图。
图4pEBADH酶切鉴定图，1.空白对照；2.PCR结果；3.质粒DNA；4.XhoI酶切质粒DNA；5.Xho I和Bgl II双酶切质粒DNA；M.分子量标记。
图5斑茅BADH蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE M.marker；1.pEBADH未加IPTG诱导；2.pEBADH经IPTG诱导4h；3.pEBADH经IPTG诱导6h；
具体实施例方式
为了更详细地阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
实施例 斑茅甜菜碱醛脱氢酶的诱导表达1、试剂配置(1)LB培养基NaCl 10g/L；酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；定容至1L，PH7.0，高压灭菌。
(2)0.5mol/L IPTG在5ml ddH2O中溶解1g IPTG，定容至8.4ml，0.22μm过滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃备用，需要时根据终浓度进行稀释。
(3)卡那霉素(100mg/L)100mg卡那霉素溶于1ml灭菌双蒸水中，-20℃保存备用。
2、BADH酶蛋白的诱导表达 取少量菌液加入含有卡那抗生素的LB培养基中，200rpm/min培养过夜；移取1/100体积的菌液于含有相应抗生素的LB液体培养基中，220rpm/min培养1.5～2.0h，使培养液的OD550约0.5～1.0，吸出1ml菌液做对照，其余加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养，然后在不同时间段(分别为1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h)取1ml菌液。对取出菌液室温高速离心1min，吸净上清，-20℃保存。进行SDS-PAGE凝胶电泳和酶活性测定检测其表达情况。
3、BADH酶活性测定方法参照中科院植物所梁峥等的实验方法。
50ml IPTG诱导细胞培养物，4℃、5000g、离心15min，去上清，然后将沉淀重悬于2ml预冷甜菜碱醛脱氢酶提取液中；加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置30min；再于4℃摇床轻摇10min；加Triton X-20、Rnase至终浓度分别为1％、5μg/mL，4℃轻摇10min；4℃、3000g、离心30min，去除不溶性细胞碎片，上清即为酶粗提液。
Bradford方法测定酶粗提液蛋白浓度。取1ml酶提取液，加入NAD母液(100mmol/L)10μl，37℃预热几分钟，再加入甜菜碱醛(5mmol/L)100μl，混匀，观测340nm OD值变化。
酶活性按每分钟转化1nmol NADH所需的酶量为一个活性单位计算。比活为每毫克蛋白的活力数。依据NADH的摩尔消光系数计算酶的活性及比活酶的比活力(nmolmin-1mg-1蛋白)＝ΔOD×10-3/(εmax×C)×109其中ΔOD吸收值每分钟增加的平均值；εmaxNADH摩尔消光系数，等于6.22×103；C测定所加酶蛋白的量，单位为毫克；10-31ml反应体系转化为升的系数；109摩尔转化为纳摩尔的系数。
4、实验结果(1)BADH酶活性(见表2)表2 IGTG处理对BADH酶活性诱导的影响

(2)BADH蛋白双向电泳结果如图5所示，pEBADH经IPTG诱导前、诱导4h和诱导6h的SDS-PAGE电泳结果。
序列表<110>福建农林大学<120>斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因与工程菌<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1518<212>DNA<213>斑茅(Erianthus arundinaceus)<400>1atggcctcgc cagcgatggt accgctgcgg cagctcttcg tcgacggcga gtggcgcccg 60cccgcgcaag accgccgcct ccccgtcgtc aaccccacca ccgaggccca catcggcgag120atcccggcgg gcacagcgga ggacgtggac gccgcggtgg cggcggcgcg ggcgacgctc180aagaggaacc gcggccgcga ctgggcgcgc gcgccggggg ccgtccgggc caagtacctc240cgcgccatcg ccgccaaggt aattgagagg aaacctgagc tggctaagct agaggcactt300gattgtggga agccttacga tgaagccgca tgggacatgg atgatgttgc tgggtgcttt360gagtactttg cggatcaggc agaagccttg gacaaaaggc aaaattcccc agtttctctt420ccaatggaaa cttttaaatg ccacctccga agagagccta ttggggtagt tgggctgata480actccttgga actatcctct cctgatggct acatggaagg tagctcctgc tctggctgct540
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<400>2Met Ala Ser Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly1 5 10 15Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Asp Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro20 25 30Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp35 40 45Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Thr Leu Lys Arg Asn Arg50 55 60Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu65 70 75 80Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys85 90 95Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Ala Trp Asp100 105 110Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu115 120 125Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr130 135 140Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile145 150 155 160Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro165 170 175Ala Leu Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala180 185 190Ser Val Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu195 200 205
Pro Ser Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly210 215 220Ala Pro Leu Ser Ala His Pro Asp Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly225 230 235 240Ser Phe Glu Thr Gly Lys Lys Ile Met Ala Ala Ala Ala Pro Met Val245 250 255Lys Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe260 265 270Asp Asp Val Asp Ile Asp Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys275 280 285Phe Trp Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val290 295 300His Thr Lys Ile Ala Lys Glu Phe Asn Glu Arg Met Val Ala Trp Ala305 310 315 320Lys Asn Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly325 330 335Pro Val Val Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Lys Ile Lys Lys Phe Ile Ser340 345 350Asn Ala Lys Ser Gln Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Val Arg Pro355 360 365Ala His Leu Glu Lys Gly Phe Phe Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp370 375 380Ile Thr Thr Ser Met Glu Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val385 390 395 400Leu Cys Val Lys Glu Phe Ser Thr Glu Asp Glu Ala Ile Glu Leu Ala405 410 415Asn Asp Thr Gln Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Ile Ser Gly Asp Arg
420 425 430Glu Arg Cys Gln Arg Leu Ser Glu Glu Ile Asp Ala Gly Cys Ile Trp435 440 445Val Asn Cys Ser Gln Pro Cys Phe Cys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Asn450 455 460Lys Arg Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Gly Gly Ile Asp Asn465 470 475 480Tyr Leu Ser Val Lys Gln Val Thr Glu Tyr Ile Ser Asp Glu Pro Trp485 490 495Gly Trp Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Leu500 50权利要求
1.斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因，其特征在于为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列。
2.斑茅甜菜碱醛脱氧酶基因工程菌，其特征在于含斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因。
3.根据权利要求2所述的斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌，其特征在于可以表达有活性的斑茅甜菜碱醛脱氢酶。
4.根据权利要求2或3所述的斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌，其特征在于所述工程菌的构建方法为以pET-29a(+)的质粒载体作为原始载体，利用限制性内切酶XhoI和Bgl II酶切斑茅BADH基因，同时用PCR扩增获得的含XhoI和Bgl II位点片段，用T4连接酶连接，利用大肠杆菌BL21菌株遗传转化，经氨苄筛选，PCR检测和酶切鉴定，获得斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌pEBADH。
全文摘要
斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因选自编码具有SEQ IDNO2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；或具有SEQ ID NO1中所示核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；或上述两种核酸分子序列互补的核酸分子。斑茅甜菜碱醛脱氢酶基因工程菌，以pET－29a(+)的质粒载体为原始载体，利用酶切、PCR扩增、酶连等方法获得pEBADH，所述工程菌可以表达有活性的斑茅甜菜碱醛脱氢酶。
文档编号C12R1/19GK1928090SQ20051001940
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月6日 优先权日2005年9月6日
发明者张木清, 陈如凯, 余爱丽 申请人:福建农林大学