专利名称：一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种运动发酵单胞菌，特别涉及一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株。
背景技术：
早在20世纪初，人们已陆续从一些酒精饮料中分离并鉴定出运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，可以作为乙醇生产菌，与酵母菌相比具有以下优点(1)吸收糖效率高，乙醇产率高；(2)产生物量少；(3)乙醇耐受力强；(4)发酵时无需控制加氧；(5)耐高渗透压；(6)易于基因操作。尽管有这些优良特性，但是，Z.mobilis仍没能取代酵母菌用于大规模乙醇生产，其主要限制因素为(1)它不能将纤维素、半纤维素和淀粉等复杂的碳水化合物多聚体转化为乙醇；(2)产生副产物，如山梨醇、3-羟基丁酮、甘油、乙醛及乙酸等；(3)产生胞外果聚糖。为了解决这些问题，许多研究者设法对Z.mobilis进行遗传改造。
专利申请号为03157515.3的发明专利“运动发酵单胞菌工程菌及其应用”，介绍了一种将四环素抗性基因插入到运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中，用内切酶消化该重组质粒，使其成为线性质粒，经转化运动发酵单胞菌XW101后，筛选具有四环素抗性的突变株。还介绍了该工程菌在发酵生产乙醇中的应用。
专利申请号为86101780的发明专利“利用运动发酵单胞菌把蔗糖转化成乙醇和其他产品”，介绍了一种利用运动发酵单胞菌菌株从以蔗糖为基础的物质中，在微好氧的条件下商业性生产乙醇、果糖和/或山梨醇等方法及优点。
发明内容
本发明的目的是通过耐酸驯化、紫外线诱变，筛选一种能发酵低pH值糖化醪的运动发酵单胞菌耐酸新菌株，降低杂菌污染，从而提高乙醇的产出率。
本发明的运动发酵单胞菌耐酸新菌株是通过对原始菌株(Zymomonasmobilis ZM6)进行耐酸驯化，紫外线诱变后，筛选出的一株可在pH3.5条件下正常生长的菌株，命名为Zymomonas mobilis ZM632，简称为ZM632，已于2005年4月28日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.1363。
本发明的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株ZM632的原始菌株购自广东省微生物研究所菌种室，编号为ZM6。通过逐步降低发酵培养基pH值的方法进行耐酸驯化，即从pH5.5→pH4.5→pH4.0→pH3.8→pH3.5→pH3.3→pH3.1，经过初步筛选获得耐酸出发菌株、传代培养，再经过紫外诱变处理，酸性杜氏发酵管初筛、小型发酵初筛和复筛，最终筛选出耐酸菌株ZM632。本发明的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株ZM632在pH值为3.3时仍可正常生长，其蔗糖利用率高、乙醇产率高，形态学特征见图1。
一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株ZM632的筛选方法，包括以下步骤1、培养基配制(1)种子培养基配制葡萄糖20g，酸母膏10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，蒸馏水1000mL，原始pH值(5.5左右)，121℃灭菌20min；含有2％琼脂的培养基为固体种子培养基，用于菌种斜面保存和菌体培养；双层平板培养基的上下层培养基均为固体种子培养基。
(2)发酵培养基配制葡萄糖100g/L(L代表1升的蒸馏水，下同)，酸母膏5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，121℃灭菌20min。
(4)酸性发酵培养基配制葡萄糖100g/L，酸母粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，用4mol/L盐酸调节培养基的pH值，121℃灭菌20min。
(5)蔗汁发酵培养基配制先将新鲜甘蔗压榨，压榨汁用纱布过滤除去固体杂质得蔗汁，置磷酸二氢钾1～5g、硫酸铵0.5～5g、硫酸镁0.5～5g于1000ml的蔗汁中煮沸5～10min，冷却至室温，用4mol/L盐酸和10％氢氧化钠调节pH值，pH值3.5～7.5，立即使用或低温保存短期备用。
2、运动发酵单胞菌的耐酸驯化通过逐步降低发酵培养基pH值的方法进行驯化原始pH5.5→pH4.5→pH4.0→pH3.8→pH3.5→pH3.3→pH3.1→筛选耐酸菌株→传代培养。
先将运动发酵单胞菌原始菌株ZM6的种子液接种(10％的接种量)于装有5mL的pH5.5发酵培养基的试管中，30℃静止培养约10h至对数生长期，为第一步耐酸驯化；从第一步耐酸驯化的培养液中取(10％的接种量)的培养液作为种子再转接于装有5mL的pH4.5的发酵培养基试管中，30℃静止培养至对数生长期为第二步耐酸驯化；依此类推，按所述的梯度转接培养至第七步耐酸驯化。
3、耐酸菌株的诱变筛选
(1)菌体的前培养和对数期培养 取新鲜斜面菌一环，接种于盛有5mL种子培养基的试管中，30℃静止培养8～12h。
取10mL该菌液转接于盛有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃静止培养10h，即菌体培养到对数生长期。
(2)制备菌悬液 取菌液80mL，离心300r/min、15min，收集菌体。沉淀用0.85％的生理盐水离心洗涤2次，将菌体充分悬浮于80mL生理盐水中。用血球计数板计数，用0.85％的生理盐水稀释菌悬液，使菌悬液的浓度为108个/mL。
(3)紫外线照射处理 在诱变处理前，开启15W紫外灯预热约20min，使光波稳定。取10mL制备的菌悬液于灭菌过的直径90mm培养皿中。盛有菌悬液并带有磁力搅拌子的培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，垂直距离30cm，紫外线照射10min，进行皿的表面消毒。开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，照射时间为40s。
(4)中间培养 表型出现要经历一个过程。方法是让诱变处理后的细胞在液体培养基中培养几个小时，让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖不少于3代，以得到纯的变异细胞。
(5)单菌落的分离 吸取1mL经中间培养后的处理液，以10倍稀释法稀释至102～104个/mL，取最后3个稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布于平板上，30℃恒温避光双层平板培养约72h。
(6)酸性杜氏发酵管初筛从定向培育的可在pH3.5条件下生长的菌株中筛选一株作为出发菌株，进行紫外线的诱变，挑取单菌落300个于盛有5mL pH3.3发酵培养基的杜氏发酵管进行初筛，筛出的菌株进行编号。
(7)小型发酵初筛和复筛经酸性杜氏发酵管初筛，得到可在pH3.3条件下生长的104株菌，分3批进行盛有150mL发酵培养基的250mL发酵瓶初筛，以出发菌株为对照，每株1瓶，30℃静止发酵，检测发酵液的最终乙醇浓度和最终残糖浓度，以最终乙醇浓度高和最终残糖浓度低为标准，每批选出2株。
将选出的6株进行盛有150mL的pH3.5和pH6.5发酵培养基的250mL三角瓶复筛，以原始菌株和出发菌株为对照，每株每一pH值三瓶，检测发酵液的最终乙醇浓度和最终残糖浓度，以最终乙醇浓度高和最终残糖浓度低为标准，选出一株发酵性能最好的菌株，该菌株即ZM632。
进一步对ZM632的发酵条件进行优化试验，得适宜于ZM632的发酵培养基的组分为蔗糖50g～500g/L，酵母粉4g～12g/L，磷酸二氢钾1g～5g/L，硫酸铵0.5～5g/L，硫酸镁0.5～5g/L；发酵培养基pH 3～7，25～45℃培养50～120小时。
由小型发酵复筛的实验结果(见表1)可以中看出，ZM632的残还原糖量最少，为9.8g/L，与原始菌株ZM6和出发菌株ZM63相比均有显著性差异；ZM632的最终乙醇浓度最大，为36.70g/L，与实验组中其他菌株的差异达到极显著性水平。
表1 耐酸菌株的复筛
表1中的数据均为平均值±标准差，采用DUNCAN测检，数字后附大小写字母者表示差异达0.01、0.05显著水平。
表2 所筛选菌株与原始菌株发酵蔗汁性能的比较
ZM632与ZM6发酵蔗汁性能进行比较，结果见表2。在pH3.5条件下，本发明筛选的耐酸菌株ZM632与原始菌株ZM6对蔗汁发酵液的发酵均较差；但在pH6.5条件下，ZM632最终乙醇浓度为56.64g/L，比原始菌株的52.18g/L提高了4.46g/L。
在工业生产过程中，杂菌污染通常是影响运动发酵单胞菌正常发酵生产乙醇的主要因素。例如糖蜜中常污染大量的微生物，大致包括野生酵母，白念球菌以及乳酸菌一类的产酸菌。由于一般的运动发酵单胞菌要求的发酵条件为pH6.5左右。一旦污染杂菌，罐内pH将迅速下降，因而严重影响乙醇发酵，这一问题在夏秋季节尤为突出。另一方面，在乙醇生产过程中，随着发酵的进行，发酵醪的pH值不断下降，一般的运动发酵单胞菌生理代谢受到抑制，导致生产性能下降。本发明筛选的耐酸新菌株ZM632具有很强的耐酸性，可以避免以上情况的发生。同时在工业乙醇发酵中，糖化醪最终pH值为4.5左右，采用耐酸性菌株可以在糖化醪制备完成后，直接用于发酵，而无需调节pH值，既降低了生产成本又简化了生产工艺。
图1为一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株ZM632的菌落形态图。
图2为葡萄糖标准曲线(y＝0.074+1.013x R2＝0.997)。其中，横轴表示OD值，纵轴表示葡萄糖浓度(g/L)。
图3为乙醇标准曲线(y＝0.180+1.216x R2＝0.997)。其中，横轴表示硫代硫酸钠消耗量(mL)，纵轴表示乙醇浓度(g/L)。
具体实施例方式
为了充分公开本发明的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，现结合实施例加以说明。
实施例ZM632利用蔗糖生产乙醇1、培养基的优化设计采用正交设计法，以消耗还原糖、总糖浓度为正交试验的指标，发酵结束后测定，要求消耗的还原糖和总糖浓度越高越好；以酒精度为发酵过程的实验指标，每12h测定一次。以蔗糖、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸镁和pH为主要研究因素，每个因素三个水平，用L18(37)正交表，因子、水平选取见表3。
表3 L18(37)因子及水平
2、葡萄糖标准曲线测定取9支25mL比色管，编号，按表4所示的量，精确加入浓度为1g/L的葡萄糖标准液和3，5-二硝基水杨酸试剂。
将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL，混匀。在520nm波长下，用1号管内的溶液调零，分别读取2～8号管的光吸收值(即OD值)。
表4 DNS法标准曲线的绘制
3、葡萄糖的测定将样品作适当稀释，使稀释后的糖浓度处于如图2所示标准曲线的糖浓度区间内，取稀释后样品1mL(以1mL蒸馏水代替样品作为空白对照)于25mL比色管中，加蒸馏水1mL，再加入3，5-二硝基水杨酸试剂1.5mL，摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL，混匀。在520nm波长下测定其OD值，求相应的还原糖浓度，按下式计算出样品的还原糖浓度样品还原糖(g/L)＝求得的还原糖浓度×样品稀释倍数4、总糖的测定吸取100mL按还原糖的测定中样品稀释液，置于200mL容量瓶中，加入6mol/L盐酸溶液10mL，在68～70℃水浴中加热15min，加水至刻度，混匀。按还原糖的测定方法测定还原糖。
蔗糖(g/L)＝(R2-R1)×0.95总糖(g/L)＝还原糖+蔗糖式中R1--不经处理后还原糖浓度，g/L；R2--水解处理后还原糖浓度，g/L；0.95--还原糖(以葡萄糖计)换算为蔗糖的系数。
5、乙醇浓度的测定——碘量滴定法(1)乙醇标准曲线在100mL容量瓶中，按表5配制乙醇标准溶液，定容到100ml。
10mL重铬酸钾溶液加入到250mL碘量瓶，缓慢加入4mL浓硫酸，摇匀冷却至室温，加入乙醇标准溶液1mL，摇匀后静止5min，加入30％的KI溶液5mL，摇匀，置暗处静止5min，加蒸馏水60mL，立即用0.5mol/L硫代硫酸钠滴定，当滴定至呈微黄绿色时，加入1％的淀粉指示剂1mL，继续滴定至呈亮绿色为终点。
表5 乙醇标准溶液
(2)样品的测定 测定步骤与制作标准曲线相同，不同之处是以加入样品0.1～1.0mL代替加入乙醇标准溶液，使所加样品中乙醇的含量落在如图3所示标准曲线的乙醇含量区间内，且对照用除去乙醇的发酵液，即2mL发酵液加入到5mL刻度试管内，沸水浴蒸发至体积一半，再加蒸馏水至2mL，即得除去乙醇的发酵液。
根据硫代硫酸钠消耗的毫升数，求得相应的乙醇含量(g/L)。
样品乙醇浓度(g/L)＝查得的乙醇浓度/所取样品的毫升数×1000
6、试验数据表6数据为不同培养基组成，发酵72～120小时所消耗的糖、产生的乙醇量。
表6 ZM652在不同培养基组分中发酵乙醇比较
7、试验结论利用正交试验设计对ZM632的发酵培养基进行优化，获得最优培养基为18号，其组分为蔗糖230g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁1g/L，pH值5.5为最佳发酵培养基，30℃培养72小时。在该条件下ZM632的糖消耗最多、酒精产量达到最大，为6.48％。以该培养基为基本培养基，按常规工业化生产乙醇的方法组织工业化生产。
权利要求
1.一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，其特征在于该菌为运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CGMCC NO.1363。
2.根据权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，其特征在于可以在pH3.5条件下正常生长。
3.根据权利要求1或2所述的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，其特征在于适宜的发酵培养基的组分为蔗糖50g～500g/L，酵母膏4g～12g/L，磷酸二氢钾1g～5g/L，硫酸铵0.5～5g/L，硫酸镁0.5～5g/L；发酵培养基pH 3～7，25～45℃培养50～120小时。
4.根据权利要求3所述的一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，其特征在于发酵培养基的组分为蔗糖230g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸铵0.5g/L，硫酸镁1g/L；发酵培养基pH 5.5，30℃培养72小时。
全文摘要
一种运动发酵单胞菌耐酸新菌株，是通过对原始菌株(Zymomonasmobilis ZM6)进行耐酸驯化，紫外线诱变后，筛选出的一株具有很强的耐酸性、可在pH3.5条件下正常生长的菌株，命名为Zymomonas mobilisZM632，简称为ZM632，已于2005年4月28日送交位于北京市中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNO.1363。
文档编号C12N1/20GK1928067SQ20051001940
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月5日 优先权日2005年9月5日
发明者张木清, 蔺玉萍, 陈柏铨, 余伟俊 申请人:福建农林大学