结核杆菌基因的检测方法

专利名称：结核杆菌基因的检测方法
技术领域：
本发明属结核杆菌基因的检测方法。
背景技术：
我国是结核杆菌感染较严重的国家之一。在我国卫生部最近公布的数据中，全国曾患结核病人数超过一亿，现有结核病人总数接近500万，其中传染病人约占一半。而每个传染病人每年可以传染15-20人。若病情一旦发展成为抗药性结核病，就很难治愈，病死率极高，故结核病是严重危害人民健康的传染型疾病之一。我国十分重视对结核病的防治，要求全国尽可能高效率的查出结核病患者，以便及时治疗，减少传播。
目前在临床上，对结核病的检测方法主要有以下几种1.传统痰涂片染色法。该法利用结核菌抗酸原理进行染色，涂片染上色的为阳性，否则为阴性。该法的优点是简单易行、经济实惠；但检出率较低，涂阳检出率往往在30％左右。随着结核病大范围防治的铺开，今后涂阴结核病的病人比例越来越高，此传统方法也就越发不能满足市场所需了。
2.结核杆菌培养法。此法显著优点是特异性和准确性高，但培养时间长(约4～6周)，检出率也只是30％左右。
3.PCR荧光检测法。该法利用PCR(聚合酶链反应)方法，扩增出大量带有萤光素的结核杆菌基因片段产物，通过萤光定量PCR仪检测。此法最大优点是高效、准确，但设备昂贵，推广使用难度大。
目前卫生部要求各地结核病患者痰样结核杆菌的检出率要达到60％，但基层现普遍采用的方法的检出率最多只能达到30％左右；各医院被怀疑为结核的组织标本检出率也低于30％，距离国家要求还很远。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、特异、高效、检出率高和实用的结核杆菌的检测方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题使用一对特异引物P1和P2对结核杆菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp区域进行PCR扩增，其中P1的5’端带有生物素。将PCR产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，再进行酶联反应，最后通过显色反应判断结果。
特异引物P1的序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’；特异引物P2的序列为5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’；膜芯片上有结核杆菌特异性检测探针T1、T2和T3以及质控探针P和N。
其中质控探针P的序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’检测探针T1的序列为5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’
检测探针T2的序列为5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’检测探针T3的序列为5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’使用本发明的结核杆菌基因的检测方法，有以下突出优点(1)由于采用PCR技术，数量极少的结核杆菌基因被成几何倍扩增了出来，故检出率高。就目前所做的数百例试验结果来看，本方法对比传统涂片法检出率高出一倍以上。
(2)由于扩增的特异性以及膜芯片探针杂交的特异性，决定了本方法具有准确性高、特异性好的优点，克服了单纯PCR带来的假阳性的问题。
(3)由于所需样品极少、使用设备普通、诊断结果直观、探针杂交显色灵敏，使其具有高效、便利、灵敏的优点。


图1是膜芯片的结构示意图。
具体实施例方式
以下简要说明本结核杆菌基因检测方法的主要原理、所用设备、试剂、具体步骤1.原理首先使用经过设计的一对特异引物P1和P2对样品进行PCR扩增，扩增的目的基因为结核杆菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp的区域，IS6110插入序列是结核分支杆菌基因组中的一个多拷贝的保守片段，序列全长约1300bp，主要在人型结核分支杆菌中发现有IS6110。引物P1的5’端标记生物素，经过PCR反应后扩增出大量含P1引物和延伸部分的DNA产物，这些产物均带有生物素。然后T1探针、T2探针、T3探针分别与产物中延伸部分的相应序列发生特异性杂交。杂交后带有生物素的目的基因与探针牢牢的联在一块，生物素就结合在了芯片上；洗去未结合的扩增基因片段；再与带有链霉亲和素的辣根过氧化物酶进行酶联反应，辣根过氧化物酶也被结合在芯片上。最后再与过氧化氢和显色剂四甲基联苯胺(TMB)进行显色反应，通过显色反应即可判断结果。三个检测探针中只要有一个出现显色反应即可判为阳性。
2.膜芯片的结构和制作制作膜芯片是在基质尼龙膜上设置三个如图1所示的检测探针T1、T2和T3，以及两个质控探针P和N；其中P为质控点，P显色，说明酶联反应成功；N为阴性对照点，N处不能显色，否则说明检测过程有污染或反应非特异。
选用的探针为质控探针P的长度为20bp，序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’检测探针T1的长度为32bp，序列为5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’，检测探针T2的长度为29bp，序列为5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’，检测探针T3的长度为32bp，序列为5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’，质控探针N可以采用不同的序列，本发明推荐了一种探针的长度为32bp，序列为5’-ttt ttt ttc cga cgc ctg cct att cgc tag ca-3’。
膜芯片的制作
膜芯片可选用宽×长为7cm×15cm。
制作步骤为a.点膜在带正电荷的尼龙膜上点上探针。其中P浓度为2.5μmol/l，(1.5～5μmol/l均可)0.3μl，T1、T2、T3、N均为25μmol/l，0.3μl。晾干。
b.烤膜60℃，30min。
3.检测所需设备PCR仪、摇床、杂交炉(有最好，没有时也可用水浴箱)、水浴箱。
4.所需试剂(1).20×SSC液(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g。溶于800ml水中，调节pH至7.0，加水定容至1L，高温高压灭菌。
(2).10％SDS(十二烷基硫酸钠)在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加几滴浓盐酸，调节pH至7.2，加水定容至1L。
(3).A液(2×SSC 0.1％SDSPH7.4)高温高压灭菌。
(4).B液(0.5×SSC 0.1％SDS pH7.4)高温高压灭菌。
(5).C液(0.1M柠檬酸钠pH5.0)高温高压灭菌。
(6)3％过氧化氢溶液5、具体步骤(1)PCR(条件多种，仅举其中之一)a.取DNA样品8微升、双蒸水13.66微升以及PCR反应液3.34微升等物组成PCR反应体系，共计25μl。
PCR反应体系的配比中模板量(样品) 8μl双蒸水 13.66μlP1 25μmol/l(20～25均可) 0.2μlP2 25mol/l(20～25均可) 0.2μl10×Buffer 2.5μldNTP 10mmol/l0.2μlTaq酶 5U/μl 0.2μlUNG(尿嘧啶糖基化酶)1U/μl0.04μl其中P1的长度为20bp，序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’，P2的长度为20bp，序列为5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’。
b.按以下程序进行PCR反应痰样37℃ 5min，95℃ 5min，94℃ 40s，55℃ 50s，72℃ 1min，共计35个循环72℃ 10min；石蜡组织37℃ 5min，95℃ 5min，94℃ 40s，55℃ 50s，72℃ 1min，共计40个循环，72℃ 10min。
c.电泳(仅在必要时做)取5μl PCR产物加3μl 6×Loadingbuffer 150v，35min电泳。由于痰样中极易出现较多且相近的杂带，所以如仅根据电泳图来判断结核杆菌的结果，就容易发生判断错误。试验结果显示，膜芯片杂交、显色反应的准确率、检出率均好于电泳观察法。
(2)杂交a.55℃(50～60℃均可)预热A液；3ml A液与膜芯片同时置入15ml有盖的试管中，膜芯片置于液面以下。每管一条。保温30～60min；b.变性产物PCR产物20-25μl置于98℃下10min，再置于冰上10min；c.杂交将b的产物加入a的产物中，55℃下保温2h；同时预热B液，55℃，40ml，30min；d.洗膜膜芯片取出放入已预热的40ml B液中，保温10min；e.酶联取出膜芯片，置于1∶2000的亲和素标记的辣根过氧化物酶(POD液)与A液的混合液中，6～8条芯片可加5μl POD、10mlA液；4～5条则加4μlPOD、8ml A液；置于摇床上轻摇10min。
f.洗膜A液室温20ml15min轻摇A液室温20ml10min轻摇C液室温20ml10min轻摇g.显色反应按顺序加入以下试剂19ml C液+1ml TMB(四甲基联苯胺)+10μl 3％过氧化氢避光显色15minh.终止显色芯片置于清水中(自来水即可)3～5min。
(3)判断结果在两个质控点无异常的条件下，T1，T2，T3任何一点显兰色即可判定为阳性。
PCR步骤之前样品的DNA的提取方法可以多种多样，使用者可根据自身情况、条件，寻找出合适的方法。以下仅各列举两种提取样品的推荐方案(1)痰样处理方法一①高温高压15min；②装入1.5ml离心管，离心12000rpm.10min.去上清；③加入痰样七倍体积的4％NaOH溶液，37℃水浴3h；④离心，12000rpm.10min.去上清；⑤沉淀用灭菌双蒸水洗两次；⑥加入100μl裂解液(5mMTris-HCI，5％Triton-100)，煮沸10min；⑦取上清用作PCR模板，剩余-20℃保存。
方法二①高温高压15min；②装入1.5ml离心管，离心12000rpm.10min.去上清；③加入90μl的PK buffer+10μl PK(蛋白酶K20g/L)；(PK buffer100mMNaCl，5mMTris-HCl，25mMEDTA pH8.0，1％SDS)；④恒温水浴37℃ 3h；⑤加入与步骤④样品等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液。混匀，离心12000rpm10min，取水相转移至一消毒过的1.5ml离心管中。酚∶氯仿∶异戊醇混合液配方为体积比25∶24∶1；⑥重复⑤一次；⑦加入0.5倍体积7.5M NH4AC或NaAC和3.5倍体积-20℃无水乙醇。-20℃放置1h。离心12000rpm 10min，倒弃乙醇；⑧加入-20℃保存的75％乙醇100μl，混匀，离心12000rpm 10min，倒弃乙醇，真空干燥(自然晾干也行)；⑨加入50μl灭菌双蒸水，溶解DNA，20min，-20℃保存。
(2)组织处理(石蜡切片)方法一①取石蜡切片10～15μm切片2～3片，溶于0.5～1ml二甲苯，静置10～15min，离心13000rpm 5min，弃上清；②重复①一次；③加入1ml无水乙醇，静置3～5min，离心13000rpm，5min，弃上清；④重复③一次；⑤真空干燥；⑥加入裂解液100μl，37℃温浴1h；⑦煮沸10min，取上清用作PCR模板，剩余-20℃保存。
方法二①取石蜡切片10～15μm切片2～3片，溶于0.5～1ml二甲苯，静置10～15min，离心13000rpm 5min，弃上清；②重复①一次；③加入1ml无水乙醇，静置3～5min，离心13000rpm，5min，弃上清；④重复③一次；⑤真空干燥；⑥5μl PK(20g/L)+90μl PK buffer，混匀，50℃1h.；⑦稍冷却，追加10μl PK，混匀，置45℃消化过夜；接着按痰样方法二⑤-⑨处理。
注文中所标百分比浓度均为质量百分比浓度。
权利要求
1.一种结核杆菌基因的检测方法，其特征是使用一对特异引物P1和P2对结核杆菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp区域进行PCR扩增，其中P1的5’端带有生物素；将PCR产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，再进行酶联反应，最后通过显色反应判断结果。
2.如权利要求1所述的结核杆菌基因的检测方法，其特征是特异引物P1的序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’；特异引物P2的序列为5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’。
3.如权利要求1或2所述的结核杆菌基因的检测方法，其特征是膜芯片是在基质尼龙膜上设置三个检测探针T1、T2和T3以及两个质控探针P和N；质控探针P的序列为5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’检测探针T1的序列为5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’检测探针T2的序列为5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’检测探针T3的序列为5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’
全文摘要
一种结核杆菌基因的检测方法，使用一对特异引物P1和P2对结核杆菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp区域进行PCR扩增，其中P1的5’端带有生物素；将PCR产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，再进行酶联反应，最后通过显色反应判断结果。用本发明的方法检测结核杆菌基因，检出率比传统涂片法检出率高出一倍以上，且准确性高、特异性好；检测时所需样品极少、使用设备普通、诊断结果直观、探针杂交显色灵敏，实现了高效、便利、灵敏、准确。
文档编号C12Q1/68GK1743462SQ20051001956
公开日2006年3月8日 申请日期2005年10月1日 优先权日2005年10月1日
发明者何敏, 周凌云, 何晓 申请人:广西医科大学