一种结核杆菌PIM糖脂疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及多糖疫苗制备，具体而言，涉及一种结核杆菌pim糖脂疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、结核病(tuberculosis)是由结核杆菌(mycobacterium tuberculosis）引起的一类慢性传染病， 以肺部结核感染最为常见，俗称肺结核。近年来随着环境污染的加剧、结核-艾滋病联合感染患者的增加以及艾滋病导致的多重耐药结核杆菌(multidrug-resistant tuberculosis， mdr-tb)的出现(frontiers in immunology，2017, 8:1)， 结核病呈现出明显上升趋势，结核病再度成为全球关注的健康问题，与艾滋病、疟疾一同被列为世界三大传染病 (nature reviews disease primers, 2016, 2:16076)。

2、在 50 多年抗结核病疫苗的研发过程中，全球科学家们开发的抗结核疫苗多达40 多个 (respirology 2018, 23, 359)，但至今仍没有发现一个比卡介苗预防效果更好的新型抗结核疫苗达到上市标准, 卡介苗目前仍然是预防结核病的唯一疫苗(vaccine,2013, 31: 223)。

3、目前， 针对结核杆菌的大部分疫苗的研究主要集中在 t 细胞识别结合在 mhc-i或 mhc-ii 表面的抗原分子（蛋白或多肽），而对于结核杆菌胞壁中 cd1 类分子提呈的糖脂类抗原的研究报道较少（international journal for parasitology， 2001, 31：1355）。甘露糖磷酯酰肌醇(phosphatidyl-inositol-mannoside, pim)是结核杆菌细胞璧脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,lam)的核心结构，近年来研究发现pim 分子在结核杆菌感染人体的过程中发挥着重要的作用，如它能抑制 γ-干扰素介导的活化、巨噬细胞的活化、t 细胞的活化等（immunity 2016, 45：1245）。因此，pim 结构分子是研发抗结核疫苗的良好靶标抗原，可以作为潜在的抗结核疫苗候选结构。

4、高纯度的 pim 分子样品难以通过微生物学手段大量获得，化学合成是解决这一问题的主要途径。目前，糖化学工作者，如 schmit 课题组、 seeberger 课题组、hung 课题组、叶新山课题组等在 pim6， pim5， pim4， pim2 等 pim 分子的合成方面做了大量的工作（nature communications, 2015, 6: 7239）， 但是这些工作主要集中在天然 pim 分子的多糖主链部分的合成，且合成得到的 pim 多糖抗原的免疫活性较低。对于非天然结构的pim分子和含有不同数目脂肪酸链的 pim 分子的合成与免疫活性的研究工作报道较少。非天然结构 pim 抗原具有比天然 pim 抗原更好的免疫特异性，设计合成非天然的pim多糖抗原与脂肪酸链结合制备糖脂疫苗，尚未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种化学方法合成的非天然结构的结核杆菌pim糖脂疫苗及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供一种结核杆菌pim糖脂疫苗，其结构式如式p1所示，

3、

4、上述结构式中，r为饱和脂肪酸。

5、根据本发明的另一方面，提供的是上述结核杆菌pim糖脂疫苗的制备方法，以母核a、糖砌块b1、糖砌块b2和甘油磷脂砌块c为主要原料，合成方法包括以下步骤：

6、步骤一，pim结构多糖部分的合成；

7、（1）糖砌块b1和母核a 在nis和tmsotf催化下发生6位羟基糖基化反应得到化合物11；

8、（2）化合物11和糖砌块b2 在nis和tmsotf催化下发生2位羟基糖基化反应得到化合物12；

9、（3）化合物12在三乙胺的thf溶液中脱保护，接着在dipea的催化下与bomcl反应得到化合物13；

10、（4）化合物13的2位乙酰基在甲醇钠的甲醇溶液中脱乙酰化得到化合物14；

11、其合成路线为：

12、。

13、步骤二，结核杆菌pim糖脂疫苗的合成；

14、（1）化合物14与砌块c在pivcl和碘的催化下发生偶联反应得到化合物15；

15、（2）化合物15在tbaf的四氢呋喃溶液中脱保护得到化合物16；

16、（3）化合物16与脂肪酸发生缩合反应，然后在pd(oh)2/c催化加氢制得化合物p1；

17、其合成路线为：

18、。

19、进一步地，上述制备方法中涉及的母核a的合成方法包括以下步骤：

20、（1）以α-甲基-d-吡喃葡糖苷1为初始原料，经tmscl对羟基保护后与苯甲醛发生环合反应，得到化合物2；

21、（2）化合物2的羟基用tbdmscl保护，在bh3的thf溶液中开环得到化合物3；

22、（3）化合物3的羟基在三氧化硫吡啶和dmso的溶液中发生氧化反应得到化合物4；

23、（4）化合物4与醋酸酐在碳酸钾催化下发生缩合反应生成化合物5；

24、（5）化合物5在醋酸汞催化下发生ferrier重排反应生成化合物6；

25、（6）化合物6的羰基经nabh(aco)3选择性还原得到母核a；

26、合成路线如下：

27、。

28、进一步地，上述制备方法中涉及的糖砌块b1、糖砌块b2的合成方法包括以下步骤：

29、（1）以d-甘露糖1为初始原料，与碘和et3sih 在乙酸酐溶剂中反应成环得到化合物7；

30、（2）化合物7的羟基用nah和卞基溴保护，然后在溴化汞的乙硫醇溶液中开环得到化合物9；

31、（3）化合物9经甲醇钠的甲醇溶液中脱乙酰化，接着与fmoc-cl的吡啶溶液反应得到糖砌块b1；

32、（4）化合物7的羟基用tbdmscl保护得到化合物8；

33、（5）化合物8的羟基用nah和卞基溴保护，然后在溴化汞的乙硫醇溶液中开环得到化合物10；

34、（6）化合物10经甲醇钠的甲醇溶液中脱乙酰化，接着与fmoc-cl的吡啶溶液反应得到糖砌块b2；

35、合成路线如下：

36、。

37、根据本发明的另一方面，提供的是上述结核杆菌pim糖脂疫苗在制备抗结核多糖疫苗中的应用。

38、本发明提供的pim糖脂化学结构明确且单一的，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。

39、通过初步的动物实验表明该pim糖脂疫苗表现了良好的活性，小鼠经免疫后血液中的抗体滴度明显增高，igg抗体的滴度在总抗体中占有较大的比例，表明本发明合成的pim糖脂是一种有效的抗结核多糖疫苗。