检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。

2、耐药结核的出现，严重影响结核病的防治工作。结核分支杆菌耐药基因的变异是产生耐药结核病的主要原因，其中过氧化物酶(katg)和烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inha)等多基因突变导致结核分支杆菌对抗结核药物异烟肼产生耐药性。

3、在结核分枝杆菌的检测中，荧光pcr技术相比涂片和培养方法具有更高的灵敏度和特异性，对含有结核分枝杆菌较低的样本也能检测出结核分枝杆菌的存在，提高了结核的检出率，加快医院对于结核病患者的干预时间。

4、pcr探针熔解曲线法分析在同一荧光通道中进行多靶标分析，可用于结核耐多药分析检测。其中，熔解曲线分析基础为采用不对称pcr产生大量的单链模板用与分子信标探针进行结合，常规的不对称pcr多采用上下游引物浓度不对称进行调节，但该方法调整难度大，引物浓度过低会导致检测灵敏度不够，浓度过高会导致双链产物过多，无法与探针相结合。

技术实现思路

1、本发明一方面提供一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，避免了常规检测方法中上游引物浓度和下游引物浓度不对称pcr所引起的灵敏度低的问题，同时结合熔解曲线分析可达到在同一通道中进行多重分析的目的，该方法具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。本发明的另一方面提供了一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的试剂盒和以非诊断为目的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的方法。

2、本发明的第一方面提供一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，包括组合物1、组合物2和组合物3，所述组合物1、所述组合物2中的上游引物与下游引物的tm值差异均为10℃，所述组合物3中的上游引物与下游引物的tm值差异为15℃，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3中的引物探针的tm值的范围为60-72℃；所述组合物1包括引物对1和引物探针1，所述组合物2包括引物对2和引物探针2，所述组合物3包括引物对3和引物探针3；

3、所述引物对1为m.tb-f-10和m.tb-r，所述引物探针1为m.tb-p；所述引物对2为katg-f-10和katg-r，所述引物探针2为katg-p1；所述引物对3为inha-f-15和inha-r，所述引物探针3为inha-p1；

4、所述m.tb-f-10的序列如seq id no.5所示，所述m.tb-r的序列如seq id no.2所示，所述m.tb-p的序列如seq id no.7所示；所述katg-f-10的序列如seq id no.12所示，所述katg-r的序列如seq id no.9所示，所述katg-p1的序列如seq id no.14所示；所述inha-f-15的序列如seq id no.20所示，所述inha-r的序列如seq id no.16所示，所述inha-p1的序列如seq id no.21所示。

5、所述的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，优选地，所述引物探针1、所述引物探针2和所述引物探针3的荧光基团互不相同且互不干涉。

6、所述的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，优选地，所述引物探针1、所述引物探针2和所述引物探针3的所述荧光基团可以互不干涉地选自fam、hex、rox、vic、cy5.5、tamra、tet、cy3和joe中的任一种。

7、本发明的第二方面提供一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的试剂盒，包括所述的组合物，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3的引物浓度为200-300nm，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3的探针浓度为50或100nm。

8、所述的试剂盒，优选地，还包括mgcl2、dntp、taq酶中的至少一种。

9、所述的试剂盒，优选地，所述mg2+的浓度为5mm，和/或，所述dntp的浓度为10mm，和/或，所述taq酶的浓度为2.5u/μl。

10、所述的试剂盒，优选地，所述组合物1的引物浓度为300nm、所述组合物1的探针浓度为50nm、所述组合物2的引物浓度为250nm、所述组合物2的探针浓度为100nm、所述组合物3的引物浓度为250nm、所述组合物3的探针浓度为100nm，所述mg2+的浓度为5mm、所述dntp的浓度为10mm和所述taq酶的浓度为2.5u/μl。

11、本发明第三方面提供一种以非诊断为目的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的方法，所述方法包括以下步骤：

12、提取待测样本的dna；

13、使用如权利要求1-3中任一项所述的组合物或权利要求4-7中任一项所述的试剂盒对所述提取的待测样本的dna利用引物tm值不对称的pcr探针熔解曲线法进行检测；

14、分析获得检测结果。

15、所述以非诊断为目的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的方法，优选地，所述利用引物tm值不对称的pcr探针熔解曲线法检测时的扩增条件为：

16、

17、

18、有益效果是：

19、本发明的试剂盒能够同时检测出结核分枝杆菌is6110基因、结核分枝杆菌katg基因和结核分枝杆菌inha基因。

20、本发明基于引物tm值差异进行不对称pcr，该方法上下游引物浓度一致，优化调整简单，且由于tm值较常规引物高，会产生更好的特异性。

21、本发明避免了常规检测方法中上游引物浓度和下游引物浓度不一致下不对称pcr所引起的灵敏度低的问题，同时结合熔解曲线分析可达到在同一通道中进行多重分析的目的，该方法具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。

技术特征：

1.一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，其特征在于，包括组合物1、组合物2和组合物3，所述组合物1、所述组合物2中的上游引物与下游引物的tm值差异均为10℃，所述组合物3中的上游引物与下游引物的tm值差异为15℃，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3中的引物探针的tm值的范围为60-72℃；

2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，其特征在于，所述引物探针1、所述引物探针2和所述引物探针3的荧光基团互不相同且互不干涉。

3.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物，其特征在于，所述引物探针1、所述引物探针2和所述引物探针3的所述荧光基团可以互不干涉地选自fam、hex、rox、vic、cy5.5、tamra、tet、cy3和joe中的任一种。

4.一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述的组合物，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3的引物浓度为200-300nm，所述组合物1、所述组合物2和所述组合物3的探针浓度为50或100nm。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括mgcl2、dntp、taq酶中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述组合物1的引物浓度为300nm、所述组合物1的探针浓度为50nm、所述组合物2的引物浓度为250nm、所述组合物2的探针浓度为100nm、所述组合物3的引物浓度为250nm、所述组合物3的探针浓度为100nm，所述mg2+的浓度为5mm、所述dntp的浓度为10mm和所述taq酶的浓度为2.5u/μl。

8.一种以非诊断为目的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述以非诊断为目的检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的方法，其特征在于，所述利用引物tm值不对称的pcr探针熔解曲线法检测时的扩增条件为：

技术总结
本发明涉及一种检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物、试剂盒及方法，其中，检测结核分枝杆菌和异烟肼耐药的组合物包括组合物1、组合物2和组合物3，组合物1、组合物2中的上游引物与下游引物的Tm值差异均为10℃，组合物3中的上游引物与下游引物的Tm值差异为15℃，组合物1、组合物2和组合物3中的引物探针的Tm值的范围为60‑72℃。本发明方法避免了常规上游引物和下游引物浓度不对称PCR检测方法所引起的检测灵敏度低的问题，同时结合熔解曲线分析可达到在同一通道中进行多重分析的目的，该方法具有操作简单、灵敏度高、可重复性好，特异性高的特点。

技术研发人员：张俊仙,李晋,孙雯娜,柳丽萍,梁艳,石太平,吴雪琼,郭求真
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第八医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6