耐高温的BstDNA聚合酶突变体及其应用的制作方法

本发明专利涉及一种耐高温的bst dna聚合酶突变体及其应用，属于生物。

背景技术：

1、自kornberg于1958年从大肠杆菌中发现并详细研究了dna聚合酶ⅰ以来，各种dna聚合酶被从原核生物和真核生物中分离并表征，并获得了生物医学界广泛的关注和应用。来源于嗜热土芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus,bst)的dna聚合酶大片段，具有较强的链置换活性和热稳定性，同时具有5’-3’dna聚合酶活性，缺失5’-3’外切酶活性，被广泛应用于恒温扩增实验，比如多重链置换扩增(multiple displacementamplification，mda)、滚环扩增(rolling circle amplification，rca)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)。环介导等温扩增技术是一种极其强大的核酸扩增方法，通过4-6个引物和具有链置换活性的dna聚合酶，可以将目标核酸在单一温度下进行连续扩增。与pcr类似，lamp对靶标核酸进行指数级的扩增，但与pcr相比，lamp不需要升温解链和降温退火，其引物结合和扩增均在一个温度下完成，并用dna聚合酶自身的链置换活性来达到模板解链的目的。因此，lamp不需要复杂的专业实验室设备即可进行，并且更加快速，这使其在医疗检测和食品行业中具有极为广泛的应用。rt-lamp是lamp技术的延伸，直接以mrna为模板进行lamp反应，可以使用具备逆转录活性的dna聚合酶或多个酶一起反应。bst dna聚合酶大片段因为同时具备的较好的dna聚合酶活性、链置换活性和热稳定性使其成为lamp和rt-lamp技术中最主流的酶。

2、尽管lamp和rt-lamp技术在诸多领域中应用广泛，但依然存在一些技术难点，比如目前lamp和rt-lamp反应温度一般在60-65℃，对于高gc含量的靶标核酸扩增效果较差，解决高gc含量模板扩增难的一个常用策略是提高反应温度，但野生型bst dna聚合酶大片段并不能胜任更高的反应温度。另外，lamp和rt-lamp的非特异性扩增也是一个技术难点，提高反应温度还可以降低一部分非特异性扩增，因此，亟需一种耐热的bst dna聚合酶来适配更高的反应温度以达到更优的检测效果。

3、鉴于此，本发明提出一种热稳定性更好的突变型bst dna聚合酶。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种bst dna聚合酶突变体，具有高的热稳定性。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种耐高温的bst dna聚合酶突变体，为如下a1-a4中任一所述的蛋白质：

4、a1：在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型bst dna聚合酶大片段的基础上进行突变得到的蛋白质，突变位点包括f67、f81、a114、d119、q128、r133、i194、v281、n283、l320、t321、q334、r339、l340、i359、s365、y429、g430、r439、f445、e461、t487、t500、m502、n503、r553、a565中的任意一个或至少两个的组合；

5、a2：将a1所示的氨基酸序列经过除前述突变以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的酶活性及热稳定性的蛋白质；

6、a3：与a1的蛋白质具有90％以上的序列同源性，且酶活性及热稳定性与a1的蛋白质基本相当的蛋白质；

7、a4：将a1-a3中任一所述的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签或酶切位点得到的融合蛋白质，该标签或酶切位点不影响bst dna聚合酶突变体的功能。

8、优选的，所述突变为f67s、f81l、a114l、d119n、q128g、r133y、i194v、v281i或l、n283l、l320p、t321a、q334c或h、r339c或h、l340r、i359l、s365d或i、y429w、g430e、r439c、f445l或i、e461k、t487n、t500a、m502v、n503s、r553h、a565v中任意一种或至少两种的组合。

9、优选的，为如下b1-b3中任一所述的蛋白质：

10、b1：在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型bst dna聚合酶大片段的基础上发生以下任意一种组合的突变得到的蛋白质：

11、(1)v16r/i359l/e461k；

12、(2)s65p/d428k；

13、(3)r133y/l320p；

14、(4)a193m/n283l；

15、(5)n204r/q128g；

16、(6)n283l；

17、(7)a409p/n462k；

18、(8)s65p/i359l；

19、(9)l68k；

20、(10)l68v；

21、(11)a114l；

22、(12)q128g；

23、(13)q182e/l340r；

24、(14)v281i；

25、(15)v281l；

26、(16)t321a/n503s；

27、(17)s365d；

28、(18)t487n；

29、(19)f445l；

30、(20)f67s/f445l；

31、(21)n204s/s365i；

32、(22)i194v；

33、(23)m33v/f81l/m502v；

34、(24)m502v/r553h；

35、(25)r339c；

36、(26)d377g/r439c；

37、(27)a565v；

38、(28)n204k/t487n；

39、(29)n204r/l320p/f445l；

40、(30)q128g/n204r/f445i；

41、(31)q334c；

42、(32)q334h；

43、(33)g430e；

44、(34)d119n/r339h/i422t；

45、(35)t500a；

46、b2：将b1所示的氨基酸序列经过除前述突变以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的酶活性及热稳定性的蛋白质；

47、b3：将b1-b2中任一所述的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签或酶切位点得到的融合蛋白质，该标签或酶切位点不影响bst dna聚合酶突变体的功能。

48、优选的，为如下c1-c3中任一所述的蛋白质：

49、c1：在氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型bst dna聚合酶大片段的基础上发生以下任意一种组合的突变得到的蛋白质：

50、(1)n204r/q128g；

51、(2)s65p/i359l；

52、(3)f67s/f445l；

53、(4)n204s/s365i；

54、(5)r339c；

55、(6)d377g/r439c；

56、(7)n204k/t487n；

57、(8)n204r/l320p/f445l；

58、(9)q128g/n204r/f445i；

59、c2：将c1所示的氨基酸序列经过除前述突变以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的酶活性及热稳定性的蛋白质

60、c3：将c1-c2中任一所述的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签或酶切位点得到的融合蛋白质，该标签或酶切位点不影响bst dna聚合酶突变体的功能。

61、优选的，所述标签为his标签，所述酶切位点为凝血酶切割位点。

62、前述的bst dna聚合酶突变体的编码基因。

63、前述的bst dna聚合酶突变体的表达载体。

64、前述的bst dna聚合酶突变体的表达宿主菌。

65、前述的bst dna聚合酶突变体在mda、rca、lamp或者rt-lamp中的应用。

66、一种试剂盒，含有前述的bst dna聚合酶突变体，可用于mda、rca、lamp或者rt-lamp技术。

67、本发明提供了bst dna聚合酶突变体，系在截短的野生型bst dna聚合酶基础上通过一个或多个不同位点的氨基酸突变而成，具有更高的热稳定性，tm值明显高于野生型bstdna聚合酶。相较于野生型bst dna聚合酶，本发明的bst dna聚合酶突变体在65℃孵育30min后残余活性明显提高，最高可进行70℃的rt-lamp反应。本发明的热稳定性提高的bstdna聚合酶突变体具有更广泛的应用温度，能适应更加复杂的应用场景。本发明的突变体还包括以下一个或至少两个的特性的提高：最适反应温度、存储稳定性、运输稳定性、持续合成能力、高gc模板的扩增能力、产物特异性、反应灵敏度等。

68、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

69、(1)本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高bstdna聚合酶的热稳定性，蛋白质熔解温度(tm)具体与野生型相比提高0.1℃以上、0.2℃以上、0.5℃以上、1℃以上；提高更多的可以是2℃、3℃、4℃以上；提高最多的达到5℃以上。

70、(2)本发明的bst dna聚合酶突变体具有提高的热稳定性，在65℃孵育30min后残余活性仍能达到80％以上。

71、(3)本发明的bst dna聚合酶突变体能在高温rt-lamp中工作，可以在70℃下完成rt-lamp反应。