一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用

本发明属于生物，具体而言，涉及一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用。

背景技术：

1、核酸药物作为一大类新兴的药物领域，具有设计快、应用广、安全性高等特点，是未来药物发展的主要方向之一。然而，由于核酸药物自身的细胞穿透性差并且容易降解，比如裸露的mrna直接进入体内会被降解，如何把mrna有效地递送到细胞内，实现高效、安全的mrna递送，从而完成蛋白的翻译制造，是mrna药物药效的保证。因此，需要开发特定的化合物及递送系统来改善这一现状，以促进核酸药物可以作为疾病预防和治疗的重要手段。

2、脂质纳米颗粒(lnp)是指将药物包封于内形成的微型泡囊体，可以保护rna不被核糖核酸酶降解、可被细胞特异性摄取、进入细胞质后能及时从内涵体中释放，使得递送的mrna能够有效表达成目标蛋白，常用作相应药物的递送载体，现在已经发展成为成熟的一类新型制剂。与传统的单层脂质体(liposomes)或脂质囊泡(vesicles)等相比，纳米脂质颗粒有更为复杂的微观结构，脂质纳米颗粒主要由胆固醇、磷脂、聚乙二醇修饰脂质、阳离子脂质等的组成，被认为在药理学上无活性且毒性小，也被认为具有一定的自佐剂功能，脂质纳米颗粒递送系统具有综合优势；但当前的脂质纳米颗粒药物递送系统也具有明显的局限性，例如缺乏靶向选择性、血液循环时间短和体内不稳定性等等，从而导致递送效率低，转染效率低，对人体有潜在刺激性或毒性，例如在个别情况下引起严重不良反应等问题和隐患等问题。

3、目前，可电离的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒(lnp)是递送核酸药物比较安全和有效的手段。lnp的原料成分主要有以下4种：1)可电离脂质或类脂质分子(如dlin-mc3-dma、l319、dlin-kc2-dma、)。这是实现体内递送mrna的核心成分。2)磷脂分子，是一种磷脂，它为lnp双分子层提供结构，也可能有助于核内体逃逸；3)胆固醇，增强lnp稳定性，促进膜融合；4)聚乙二醇，它可以控制并减少lnp的粒径，并“保护”lnp不受免疫细胞非特异性内吞作用的影响。

4、而且目前已上市的可用与制备lnp的可电离脂质还很少，还需要大量设计和筛选更合适的可电离阳离子脂质，来帮助解决lnp存在的递送效率低，转染效率低，或具有细胞毒性等问题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用，本发明提供的可电离脂质具有良好的递送效率、转染效率和较低的毒性，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。

2、一方面，本发明提供了一种可电离的阳离子化合物，具有如式(ⅰ)所示的结构，或者含有式(ⅰ)所示的结构的盐或衍生物，

3、

4、其中，r1、r2、r3、r4、r5中的任意两个为另外三个为h，

5、m、n大于或等于1，a分选自-s-、-s-s-、-coo-、-o-co-o-中的任意一种，r’为碳原子数量大于或等于1的脂肪链。

6、优选的，所述r2、r4为r1、r3、r5为h。

7、根据上述优选的化合物结构制备得到的可电离脂质，即三条尾部彼此为间位的化合物制备得到的可电离脂质，具有更低的毒性。

8、苯环上连接的三条链处于不同位置的化合物，化合物苯环上连接的三条链的位置与对应化合物制备的可电离脂质的mrna递送效率、转染效率、安全性和内涵体逃逸能力、毒性有直接联系，因此可灵活调整结构以得到适合的可电离阳离子化合物。在本发明创新地提出苯环上连接的三条链的结构后，在苯环上取代在不同的位置属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。

9、本发明对符合式(ⅰ)的多种化合物进行了测试，发现r2、r4为r1、r3、r5为h时，化合物制备得到的可电离脂质的毒性较低。

10、本发明中的r’为碳原子数量大于或等于1的脂肪链，是因为r’在结构上的作用是作为一条疏水链影响可电离脂质的组装结果、mrna转染效果等，脂肪链具有疏水性，且可根据所需要的疏水性灵活调整r’的脂肪链结构，例如调整链长、支链个数等，在明确了r’结构与化合物功能之间的联系后，在脂肪链的框架内进行调整均属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。

11、此外，n的取值影响尾部长度，进而影响可电离脂质的组装结果、水解速度等，理论上n可以从整数1开始无限向上递增，逐渐增加尾部长度，在一定范围内增加长度能促进水解，进而降低毒性，而过度增加尾部长度，则难以水解，因此在明确n取值与化合物功能之间的联系后，对n取值进行调整均属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。

12、优选的，所述m选自2、3、4中的一种。

13、进一步优选的，所述m为3。

14、优选的，所述a选自-coo-或-s-s-。

15、根据本发明对多种a结构的测试结果，调整a的结构会对化合物制备得到的可电离脂质的性质产生影响，a选择二硫键则脂质易降解毒性低，a选择酯键则脂质的mrna转染效率好。

16、从原理上看，将生物降解性引入可电离脂质的常见策略是通过包含在生理ph下稳定但在组织和细胞内酶促水解的酯键。不同类型的化学键的降解性会有所不同，会导致lnp在体内有不同的循环周期，降解过快会导致较差的效力，因此引入生物降解性需要平衡活性-降解性权衡以最大化总效益。同时酯基的位置和空间效应可以极大地影响可电离脂质清除率和效力。所以导致a为酯键的化合物在保证生物安全性的同时表现出最佳的转染效率。

17、本发明在苯环类的阳离子脂材中，首次引入了-s-s-键作为可降解的官能团，即a选择二硫键-s-s-，由于胞内的谷胱甘肽(gsh)浓度相较于胞外要高，在进入胞内之后，可以与gsh发生响应，然后二硫键断裂，阳离子脂材可以迅速代谢，将mrna迅速释放，从而提高了转染效率，降低了毒性。

18、进一步的，所述r’不含支链，或为支链长度相同的双链，或为支链长度相同的三链。

19、优选的，所述r’为碳原子数量大于或等于9的脂肪链。

20、进一步优选的，所述r’为碳原子数量等于11的支链脂肪链。

21、进一步优选的，所述r’为碳原子数量等于17的双链脂肪链。

22、优选的，r2和r4各自独立选自

23、进一步优选的，r2为r4为

24、不同疏水链的选择提高了组装效率、递送效率，进而提高了转染效率。从原理上看，引入支链的酯基r2可以增强其蛋白表达能力，直链的酯基r4的水解是脂质代谢的第一步，过量的r4由于快速的降解会减弱蛋白表达，不同的尾部可以平衡转染效率和降解性，增强转染效率。

25、优选的，所述m选自2、3、4中的一种。

26、进一步优选的，所述m为3。

27、对于苯环上连接的尾部，本发明设计的结构可以通过控制投料比选择性地得到不同尾部结构的可电离脂质，同时对脂质的头部结构也可进行选择。可以通过调节尾部链的长短、支链的个数得到不同结构的尾部，达到转染效率和体内降解平衡，影响最终自组装形成的脂质体，同时可扩大脂质库的筛选范围从而更大可能得到转染效率更高的脂质。

28、通过本发明的试验筛选，得到了一种mrna递送和转染效率极高、安全性和内涵体逃逸能力高。毒性低的可电离的阳离子化合物(化合物11)，具体如下式所示：

29、

30、化合物11制备的脂质纳米颗粒具有最佳的mrna转染及递送效率、安全性和内涵体逃逸能力、以及极低的毒性；从结构上来看，化合物11的三条尾部结构均不同，含n的链上含有酯基，有利于mrna的递送和转染，另外两条尾部的链长度适中，因此具有良好的内涵体逃逸能力，此外结构中含有多个酯键，且酯键所处的化学环境利于水解，降解速率快，因此具有较低的细胞毒性。

31、另外，本发明筛选得到了一种低毒性的可电离的阳离子化合物(化合物1)，具体如下式所示：

32、

33、化合物1含有二硫键，胞内的谷胱甘肽(gsh)浓度相较于胞外要高，在进入胞内之后，化合物1可以与gsh发生响应，然后二硫键断裂，阳离子脂材可以迅速代谢，将mrna迅速释放，从而提高了转染效率，降低了毒性。

34、另一方面，本发明提供了一种脂质复合物，包括所述的可电离的阳离子化合物。

35、进一步的，还包括治疗或预防剂。

36、进一步的，治疗或预防剂选自核酸药物、小分子药物、蛋白质药物、药物活性分子中的任意至少一种。

37、在一些方式中，核酸药物选自dna药物、rna药物中的任意至少一种；rna药物选自mrna、sirna、airna、mirna、dsrna、arna、lncrna中的任意至少一种。

38、在一些方式中，蛋白质药物选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。

39、进一步的，还包括磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质中的任意一种或多种。

40、优选的，磷脂选自二硬脂酰磷脂胆碱(dspc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺中的任意至少一种。

41、进一步优选的，磷脂为二硬脂酰磷脂胆碱(dspc)。

42、优选地，结构性脂质选自胆固醇、β胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。

43、进一步优选地，结构性脂质为胆固醇。

44、优选地，peg脂质选自peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的磷脂酸、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二酰基甘油、peg改性的二烷基甘油中的任意至少一种。

45、进一步优选地，peg脂质为dmg-peg 2000(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000)。

46、在一些方式中，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为10-100:0-50:0-50:0-5。

47、优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为30-80:2-20:30-50:0.5-5。

48、进一步优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为40-60:5-15:35-45:0.5-2。

49、更进一步优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。

50、在一些方式中，所述复合物为脂质纳米粒。

51、优选地，脂质纳米粒的粒径为30至300nm，zeta电位为-30至30mv，

52、更优选地，脂质纳米粒的粒径为70至140nm，脂质纳米粒的zeta电位为-10至15mv。

53、另一方面，本发明提供了一种脂质复合物的制备方法，包括以下步骤：

54、(1)将所述的可电离的阳离子化合物，和磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质中的任意一种或多种溶于有机溶剂，获得有机相溶液；

55、(2)将治疗或预防剂与缓冲液混合，获得水相溶液；

56、(3)将有机相溶液与水相溶液混合，获得脂质复合物。

57、在一些方式中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基吡咯烷酮中的任意至少一种。

58、在一些方式中，缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。

59、优选地，柠檬酸盐缓冲液的浓度为5-80mm，柠檬酸盐缓冲液的ph＝2-6。

60、进一步优选地，柠檬酸盐缓冲液的浓度为10-50mm，柠檬酸盐缓冲液的ph＝3-5。

61、在一些方式中，复合物的n/p＝1-15。

62、优选地，复合物的n/p＝6。

63、另一方面，本发明提供了一种所述的可电离的阳离子化合物用于制备提高脂质复合物的递送效率和/或转染效率的制剂的用途。

64、另一方面，本发明提供了一种所述的可电离的阳离子化合物用于制备降低脂质复合物的细胞毒性的制剂的用途。

65、另一方面，本发明还提供了一种所述的可电离的阳离子化合物或其药物可用的盐的用途，包括如下1)-4)中的至少一种，

66、1)包封治疗或预防剂；

67、2)治疗或预防剂体外细胞转染；

68、3)制备治疗或预防剂体内递送试剂；

69、4)制备转染试剂盒。

70、本发明具有以下有益效果：

71、1、本发明为可电离脂质设计了一种全新的可电离的阳离子化合物，能够制备一种全新的可电离脂质及其复合物，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展；

72、2、本发明提供的复合物为脂质纳米粒，其纳米粒大小均一，粒径为70至140nm，zeta电位为-10至15mv，包封率≥85％；

73、3、本发明提供的复合物具有优异的生物安全性，对细胞的毒性低，不会引起溶血现象；

74、4、本发明提供的复合物具有良好的递送效率和转染效率，制备简单，路线简短。