一种复合发酵菌种及其制备方法和应用
【专利说明】一种复合发酵菌种及其制备方法和应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种复合发酵菌种及其制备方法和应用，尤其是涉及一种用于水牛乳 发酵酸奶的复合发酵菌种及其制备方法和应用。 【技术背景】
[0002] 水牛乳是中国南方地区的一种特色乳品，具有高质、安全、少有的特点。水牛乳 产量较低，但其所含蛋白质、乳脂、维生素、微量元素等均高于黑白花牛奶，被誉为"奶中之 王"。目前我国水牛乳加工产业还处于初级阶段，主要以液态乳为主，高附加值产品较少。
[0003] 酸奶是以牛乳为原料，经巴氏杀菌冷却后加入乳酸菌发酵而成的产品，其发酵乳 含有大量的益生菌，具有调节胃肠道菌群，改善机体免疫系统等功效，因而倍受欢迎，市场 发展潜力巨大。
[0004] γ-氨基丁酸（简称GABA)是一种天然非蛋白氨基酸，大量研究已表明，GABA具有 降血压、抗惊厥、镇痛、改善睡眠、解毒等多种生理功能。水牛乳酸奶和GABA可谓是完美组 合，利用乳酸菌发酵得到富含GABA的水牛乳酸奶，可进一步提升酸奶的营养价值，使其具 有更多GABA方面的生理功效，以满足人们对功能性食品的高要求，应运市场的发展，同时 也是目前水牛乳加工产业急需解决的问题。而目前发酵水牛乳酸奶大多采用嗜热链球菌和 保加利亚乳酸杆菌，这些菌种发酵制得的酸奶口感爽滑，组织状态细腻，但不产GABA，只是 单纯地具备普通酸奶的营养价值。另外，现有水牛乳酸奶制作工艺中，还时有选用菌种或菌 种配比不当造成发酵过程中凝乳过粘、组织状态过硬等问题。 【
【发明内容】
】
[0005] 鉴于以上提出的问题，本发明提供了一种用于水牛乳酸奶的复合发酵菌种及其制 备方法和应用。
[0006] 本发明人经研究发现，从生水牛乳中分离出的乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactobacilluslactissubsp.lactis) 25#，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015. 11. 25，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ2015700,和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum) 12#，保藏于中国典型培养物保 藏中心，简称CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015. 11. 25,保藏编 号为CCTCCΝ0:Μ2015699,这两种菌种均能产γ-氨基丁酸，且产量较高，故考虑将以上两 种菌种与传统酸奶菌种嗜热链球菌混合制得一种可产γ-氨基丁酸的复合发酵菌种，进而 将所述复合发酵菌种运用到水牛乳酸奶的发酵中，以制得一种富含γ-氨基丁酸的水牛乳 酸奶，使所得酸奶在原有普通酸奶营养价值的基础上，增加了γ-氨基丁酸的特殊生理功 效，进一步提高了酸奶的高附加值。
[0007] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种复合发酵菌种，所述复合 发酵菌种由乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌和嗜热链球菌经活化后按照质量比为1-2 : 1 :1-2的比例混合而成，优选所述复合发酵菌种由乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌和嗜 热链球菌经活化后按照质量比为2 :1 :1的比例混合而成，所述乳酸乳球菌乳酸亚种和植 物乳杆菌均自生鲜水牛乳中分离而得；分离所得乳酸乳球菌乳酸亚种为乳酸乳球菌乳酸 亚种（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#，于 2015 年 11 月 25 日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0:M2015700 ;分离所得植物乳杆菌为植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum) 12#，于2015年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCN0:M2015699,而嗜热链球菌（保藏编号为CGMCC2718)，购于中国普通 微生物菌种保藏管理中心。
[0008] 所述复合发酵菌种的制备方法包括如下步骤：
[0009]a)将乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌和嗜热链球菌分别在MRS斜面培养基连续 二次复苏传代培养，得菌株；
[0010] b)将步骤a)所得菌株分别接种至lOOmlMRS肉汤培养基中，35-40°C摇床培养 20-24h，得培养菌液；
[0011] c)将步骤b)所得培养菌液分别用离心机，以4800-5200rpm的转速离心6-10min， 收集上清液，得到目的菌液，即活化的乳酸乳球菌乳酸亚种、植物乳杆菌和嗜热链球菌；
[0012] d)将步骤c)所得三种目的菌液按所述比例调配均匀后接种到灭菌后的脱脂水牛 乳中，接种量为脱脂水牛乳总质量的20%，再置于37°C摇床培养16-24h，即得所述复合发 酵菌种。该菌种的保存方式可采用冻干保存或甘油管保存。
[0013] 其中，步骤a)中，所述MRS斜面培养基含如下组分：蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母 粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2. 0g，柠檬酸氢二铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰 0· 04g，琼脂 14g，吐温-80lg，蒸馏水 1000mL。
[0014] 步骤b)中，所述MRS肉汤培养基含如下组分：酪蛋白酶消化物10g，肉膏粉10g，酵 母膏粉4g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，硫酸氢二钾2. 0g，葡萄糖 20g，吐温-80 1. 08g，蒸馏水 1000mL。
[0015] 所述复合发酵菌种可应用于水牛乳酸奶的发酵。将该复合发酵菌种按照质量百分 比5-10%的接种量加入脱脂水牛乳中发酵酸奶，所得酸奶不仅具备普通酸奶的营养价值， 还富含γ-氨基丁酸，从而附加了γ-氨基丁酸所特有的降血压、抗惊厥、镇痛、改善睡眠、 解毒等多种生理功能。
[0016] 本发明提供了一种复合发酵菌种及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有以 下有益效果：本发明所提供的复合发酵菌种由自生鲜水牛乳中分离出的乳酸乳球菌乳酸亚 种和植物乳杆菌两种菌株与传统酸奶菌种嗜热链球菌混合制得，该复合发酵菌种中，乳酸 乳球菌乳酸亚种和植物乳杆菌均产γ-氨基丁酸，具有降血压、抗惊厥、镇痛、解毒等多种 生理功能性，将该复合发酵菌种应用于水牛乳酸奶的发酵，所制得的酸奶中富含γ-氨基 丁酸，从而可使其在原有普通酸奶营养价值的基础上，同时增加γ-氨基丁酸的特殊生理 功效；另有，该复合菌种中的乳酸乳球菌乳酸亚种和植物乳杆菌均分离自水牛乳，后又将该 复合菌种应用于水牛乳酸奶的发酵，可谓"源于水牛乳而用于水牛乳"，可实现资源的高附 加值循环利用。再有，该发酵菌种用于水牛乳发酵酸奶，发酵过程中不会出现凝乳过粘、组 织状态过硬等问题，制得酸奶乳香浓郁、质地黏稠、口感细腻，且酸奶中乳酸菌活菌数高，乳 清析出量少，产品后酸化程度可控，保质期长。 【【具体实施方式】】
[0017] 下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不可以以任何 方式限制本发明。
[0018] 下述各实施例中，无特别说明，涉及的比例均为重量比。
[0019] 下述实施例中，所涉及的检测方法如下：
[0020] 脂肪测定方法：参照GB5413. 3 ;
[0021] 蛋白质测定方法：参照GB5009. 5 ;
[0022] 酸度测定方法：参照GB5413. 34-2010 ;
[0023] 乳酸菌活菌数计数方法：参照GB2746-1999 ;
[0024] γ-氨基丁酸（GABA)测定方法：高效液相色谱法（HPLC)。
[0025] 下述实施例中原料及设备来源：
[0026] 下述实施例中，所米用的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactobacilluslactissubsp. lactis) 25#和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum) 12#均分离自生鲜水牛乳，其中，乳 酸乳球菌乳酸亚种（Lactobacilluslactissubsp.lactis) 25#，保藏于中国典型培养物保 藏中心，简称CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:Μ2015700， 保藏日期为2015. 11.25 ;植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum) 12#，保藏于中国典型 培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:Μ 2015699,保藏日期为2015. 11. 25。所采用的嗜热链球菌购于中国普通微生物菌种保藏中 心，保藏编号为CGMCCΝ0:1·2718。
[0027] 水牛乳，广西水牛研究所种水牛场；MRS培养基，青岛科园海博生物技术有限公 司；MRS肉汤，广东环凯微生物科技有限公司；低速大容量离心机：型号：DD- 5M;冷冻干燥 机：ALPHAl-2LDplus型，德国MARTINCHRIST公司；三用恒温水槽型号：DK- 600S，上海精 宏实验设备有限公司；电子天平ME204E/02梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
[0028] 实施例1
[0029] -种复合发酵菌种，所述复合发酵菌种由自生鲜水牛乳中分离出的乳酸乳球 菌乳酸亚种（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 12#和传统酸奶菌种嗜热链球菌经活化后按质量比1 :1 :1混合制得，其制备方 法为：先按照如下原料配比配制MRS斜面培养基和MRS肉汤培养基，其中，所述MRS斜面 培养基含如下组分：蛋白胨l〇g，牛肉粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2. 0g，柠 檬酸氢二铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 04g，琼脂14g，吐温-80lg，蒸馏水 1000mL;所述MRS肉汤培养基含如下组分：酪蛋白酶消化物10g，肉膏粉10g，酵母膏粉4g， 柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0. 2g，硫酸锰0. 05g，硫酸氢二钾2. 0g，葡萄糖20g，吐 温-80 1.08g，蒸馏水1000mL。随后，将冻干保存的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactobacillus lactissubsp.lactis) 25#、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum) 12# 和嗜热链球菌分 别在MRS斜面培养基连续二次复苏传代培养，得菌株；再将所得菌株分别接种至lOOmlMRS 肉汤培养基中，35 °C摇床培养24h，得培养菌液；进而将所得培养菌液分别用离心机以 4800rpm的转速离心10min，收集上清液，得到目的菌液，即活化的乳酸乳球菌乳酸亚种、植 物乳杆菌和嗜热链球菌；最后将所得三种目的菌液按所述比例调配均匀后接种到灭菌后的 脱脂水牛乳中，接种量为脱脂水牛乳总质量的20%，再置于37°C摇床培养16h，即得所述复 合发酵菌种。
[0030] 实施例2
[0031] -种复合发酵菌种，所述复合发酵菌种由自生鲜水牛乳中分离出的乳酸乳球 菌乳酸亚种（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 12#和传统酸奶菌种嗜热链球菌按质量比2 :1 :1混合制得，其制备方法为：按 照实施例1相同的配方配制MRS斜面培养基和MRS肉汤培养基；将冻干保存的乳酸乳球 菌乳酸亚种（Lactobacilluslactissubsp.lactis)25#、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 12#和嗜热链球菌分别在MRS斜面培养基连续二次复苏传代培养，得菌株；将所 得菌株分别接种至lOOmlMRS肉汤培养基中，37°C摇床培养22h，得培养菌液；将所得培养 菌液分别用离心机以5000