专利名称：木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组合发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用发酵或使用酶的方法生产乙醇的工艺，尤其涉及一种从纤维素材料 基质中用发酵或用酶的方法生产乙醇的工艺。
背景技术：
随着传统化石燃料供应的日益紧张以及化石燃料的不可再生性，燃料乙醇作为理想的替 代能源之一受到越来越多的关注。相比于汽油，乙醇具有更高的辛烷值，燃烧更洁净高效， 产生更少的臭氧前体物和C02。目前，几乎所有的燃料乙醇都是利用粮食原料生产出来，美
国主要利用玉米，巴西主要利用蔗糖，但绝大多数国家不具有这样的农业基础生产燃料乙醇。 人们不得不把目光转向供应更丰富价格更低廉的木质纤维素，如农林废弃物(包括农作物秸 秆、甘蔗渣、锯木屑、刨花等)。尽管木质纤维素原料供应充足且价格低廉，但由于转化成乙 醇的工艺复杂且成本较高而阻碍了这种重要资源更广范围的利用。目前木质纤维生物质转化 成乙醇的关键问题，是缺少低成本的打破木质素与纤维素紧密结合使纤维素和半纤维素解聚 而释放出游离的糖分子的技术，缺少高效利用己糖和戊糖生产乙醇的发酵工艺。
多数木质纤维素原料中，纤维素(约占干重的35%至50%)被其它结构性生物高分子包 埋，主要是半纤维素(占干重的20% 30%)和木质素(占干重的5% 30%),但只有纤维素和 半纤维素可解聚生成可被用于发酵乙醇的单糖分子，而这种结构阻碍了纤维素和半纤维素的 有效利用，且纤维素本身的晶体结构也不利于酶解。木质纤维原料的理化特性决定了其具有 不同于淀粉(如玉米、高粱)和糖类(如甘蔗、甜菜)原料转化的难度和复杂性。此外，在 乙醇发酵方面，适宜乙醇发酵的酿酒酵母(Sacc/^om少cMce/^v/w'"e，中国工业微生物菌种保 藏中心CICC1517)与运动发酵单胞菌(ZjwowomwwoWto，美国典型培养物保藏中心ATCC 31821 )只能代谢葡萄糖而不能代谢木糖，而能够利用木糖发酵生产乙醇的菌种大肠杆菌KOll
(j&cfen'c似"co//，美国典型培养物保藏中心ATCC 55124)对乙醇的耐受力又不如前两者。
发明内容
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本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低廉、环保 无污染且能有效提高乙醇产量和木质纤维利用率的木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组合发酵 工艺。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组 合发酵工艺，包括蒸汽爆破预处理、酶解糖化和乙醇发酵三个歩骤，其特征在于所述乙醇发 酵是指将酶解糖化制得的酶解液调pH值至6.0-7.5后，接种大肠杆菌KOll和酿酒酵母进行发酵，或者接种大肠杆菌KOll和运动发酵单胞菌进行发酵，或者接种大肠杆菌KOll、酿酒 酵母和运动发酵单胞菌进行发酵。
上述蒸汽爆破预处理是指在蒸汽爆破装置中装入木片(长2.5~5cm、宽2~3cm、厚 0.2~0.5cm)，并使蒸汽爆破装置中维持200 24(TC的温度、2~5 MPa的蒸汽压力10-25分钟， 再瞬间释放压力。所述木片的木料主要来自杨木或杉木。所述的蒸汽爆破装置可以选用市场 上销售的蒸汽爆破仪，其一般包括蒸汽发生器、恒压反应器和接收装置几个主要部分；恒压 反应器呈直立圆筒状，将木片放入恒压反应器中以后随即通入高温(如21(TC)蒸汽，同时 利用恒压反应器上的夹套进行加热，达到设定的温度、压强和维压时间后打开恒压反应器底 部的球阀释放压力，爆破完成。
上述工艺中的酶解糖化步骤具体包括以下工序调节蒸汽爆破预处理后所得木浆的pH 值至4.5 5.5，按每克爆破木浆干重(木浆干重可用放入的木片质量近似替代)添加20 50FPIU 的纤维素酶，在45 55'C条件下酶解48 72h，酶解时的搅拌速度为100~250 rpm。
上述工艺的乙醇发酵过程中，酶解液的pH值可以用3M的氢氧化钾溶液进行调节，发酵 前进行微生物接种时，先接种预先培养的大肠杆菌KOll至大肠杆菌KOll细胞干重在调pH 值后的酶解液中初始浓度达到0.16 0.33mg/ml，再接种预先培养的酿酒酵母和/或运动发酵单 胞菌至酿酒酵母和/或运动发酵单胞菌细胞干重在调pH值后的酶解液中初始浓度达到 0.12~0.45 mg/ml。
上述工艺的乙醇发酵过程中，乙醇发酵的发酵时间为48 96h，发酵温度为30 35。C，发 酵时的搅拌速度为100 250rpm。
与现有技术相比，本发明的优点在于首先，通过蒸汽爆破预处理来增加生物酶与木质 纤维素的接触面积，进而提高酶解效率；其次，通过综合利用多菌种进行组合发酵，有效释 放木质纤维素中的纤维素和半纤维素成分，获得高产量的乙醇，提高木质素纤维的利用率。 本发明的方法工艺简单、成本低、环保无污染，对于解决目前能源短缺及开辟新能源来源渠 道的问题，具有重要的现实意义。
图1为本发明的工艺流程图。 .具体实施方式
实施例1
一种木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组合发酵工艺，包括以下步骤
(1)蒸汽爆破预处理将杨木(也可用杉木)切成长2.5~5 cm、宽2~3 cm、厚0.2~0.5 cm 的木片，取150g的木片装入蒸汽爆破仪(可外购)中，于24(TC， 3MPa的蒸汽压力下维持20分钟，再瞬间释放压力，使木片爆破成木桨；
(2) 酶解糖化取2 L爆破后的木浆倒入体积为3L的发酵罐中，此时发酵罐中纤维素 含量约为3.5% (w/v)(—般小于6.5%)，用3M氢氧化钾溶液调节爆破木浆的pH值至4.8， 加入2100FPIU的纤维素酶，在温度48°C、搅拌速度150 rpm的条件下酶解72 h得到酶解液；
(3) 乙醇发酵将酶解液用3M氢氧化钾溶液调节至pH值为6.5，接种预先培养的大肠 杆菌KOll至其细胞干重在酶解液中的初始浓度为0.33mg/ml，再接种预先培养的酿酒酵母菌 液100ml，发酵温度为30 35 °C，搅拌速度为100~200 rpm，发酵96h后测定乙醇含量。
相比于分别利用大肠杆菌KOll或酿酒酵母发酵的乙醇产量1.452g/l和3.356g/l，本实施 例利用大肠杆菌KOll和酿酒酵母混合发酵的乙醇产量可达到3.526 g/l。
实施例2
本实施例的步骤(1)蒸汽爆破预处理和步骤(2)酶解糖化与实施例1相同，但在步骤 (3)乙醇发酵过程中，利用运动发酵单胞菌替代酿酒酵母，其余工艺参数不变。
实验结果表明，相比于分别利用大肠杆菌K011或运动发酵单胞菌发酵的乙醇产量1.452 g/1和2.144 g/1，本实施例利用大肠杆菌K011和运动发酵单胞菌混合发酵的乙醇产量可达到 2.795 g/1。
实施例3
本实施例的发酵罐中纤维素含量约为6.1% (w/v)，在乙醇发酵过程中，取预先培养的大 肠杆菌KOll、酿酒酵母、运动发酵单胞菌各200ml (大肠杆菌KOll培养l天、酵母培养2 天、运动发酵单胞菌培养4天)离心混合后得沉淀，加入无菌水制成3菌种混合菌悬液共50ml， 加入混合菌悬液至发酵罐进行发酵。其余步骤及工艺参数与实施例1、实施例2相同。
结果表明，本实施例利用大肠杆菌KOll、酿酒酵母和运动发酵单胞菌3菌种混合发酵 的乙醇产量可达到13.79 g/1。
上述各实施例中大肠杆菌K011接种物通过以下方法制备1L摇瓶中装入500ml 土豆-葡萄糖(LB)培养基，添加质量浓度10%的葡萄糖，接种大肠杆菌KOll， 30°C、 100rpm条 件下培养24小时；10000xg条件下离心10分钟，去上清，LB培养基悬浮液作为接种物。
上述各实施例中酿酒酵母接种物通过以下方法制备准备培养基，其中包含胰蛋白胨 10g/l、酵母膏5 g/l、 NaCl2 10 g/l、 MgS04 0.25 g/l、 KH2P042.5 g/l、 CaCl2 0.25 g/1和葡萄糖 15g/l，调节培养基的pH值至7.0 7.2，接种酿酒酵母，30°C、 150 rpm条件下培养48 h作为接种物。
上述各实施例中运动发酵单胞菌接种物通过以下方法制备准备培养基，其中包含100 g/1
的葡萄糖、10g/l的酵母膏和2g/l的KH2PO4，接种运动发酵单胞菌，在pH值为6.0、 32°C、 150 rpm的条件下培养96 h后作为接种物。
上述各实施例中产出的乙醇含量采用气相色谱法进行测定。气相色谱法的主要参数如下
气相色谱仪PerkinElmer Clarus 500;色谱柱HP-INNOWAX;
载气高纯氮气；载气流速Upsi;
检测器氢离子火焰检测器(FID);检测器温度为25(TC; Hb流速45ml/min;空气流速450ml/min;
进样口温度20(TC;
进样方式分流，分流比为30:1;进样量0.6^1;
炉温程序升温，初始温度50。C， 10°C/min升至120°C， 20。C/min升至180°C，共10min; 样品的制备发酵液10000xg，离心10分钟，取0.9ml上清液，加入0.1ml 0.8g/l的正 丙醇作为内标物，用lml正丁醇萃取IO分钟。
权利要求
1、一种木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组合发酵工艺，包括蒸汽爆破预处理、酶解糖化和乙醇发酵三个步骤，其特征在于所述乙醇发酵是指将酶解糖化制得的酶解液调pH值至6.0～7.5后，接种大肠杆菌KO11(Escherichia coli，ATCC55124)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，CICC1517)进行发酵，或者接种大肠杆菌KO11和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis，ATCC31821)进行发酵，或者接种大肠杆菌KO11、酿酒酵母和运动发酵单胞菌进行发酵。
2、 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述的蒸汽爆破预处理是指在蒸汽爆破装置 中装入木片，并使蒸汽爆破装置中维持200 24(TC的温度、2-5MPa的蒸汽压力10 25分钟，再瞬间释放压力。
3、 根据权利要求2所述的工艺，其特征在于所述木片的木料来自杨木或杉木。
4、 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述酶解糖化具体包括以下工序调节蒸汽 爆破预处理后所得木浆的pH值至4.5~5.5，按每克爆破木浆干重添加20~50 FPIU的纤维素酶， 在45 55。C条件下酶解48 72h，酶解时的搅拌速度为100 250卬m。
5、 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述大肠杆菌KOll的接种量满足大肠杆菌 K011细胞干重在调pH值后的酶解液中初始浓度达到0.16 0.33 mg/ml;所述酿酒酵母和/或 运动发酵单胞菌的接种量满足酿酒酵母和/或运动发酵单胞菌的细胞干重在调pH值后的酶解 液中初始浓度达到0.12~0.45 mg/ml。
6、 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所述乙醇发酵过程中，发酵时间为48 96h， 发酵温度为30 35 °C，发酵时的搅拌速度为100 250rpm。
全文摘要
本发明公开了一种木质纤维生产燃料乙醇的多菌种组合发酵工艺，包括蒸汽爆破预处理、酶解糖化和乙醇发酵三个步骤，其中乙醇发酵是指将酶解糖化制得的酶解液调pH值至6.0～7.5后，接种大肠杆菌KO11和酿酒酵母进行发酵，或者接种大肠杆菌KO11和运动发酵单胞菌进行发酵，或者接种大肠杆菌KO11、酿酒酵母和运动发酵单胞菌进行发酵。本发明的多菌种组合发酵工艺具有操作简单、成本低廉、环保无污染且能有效提高乙醇产量和木质纤维素利用率等优点。
文档编号C12P39/00GK101475976SQ20081023749
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者易琳琳, 王义强, 章怀云, 艾斌凌, 陈介南 申请人:中南林业科技大学