利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3‑丁二醇产量的方法与流程

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种利用混菌提高乙偶姻和2,3-丁二醇的方法。

背景技术：

乙偶姻是一种风味添加剂，可广泛应用于制药行业、化工行业等。2，3-丁二醇作为一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于医疗、化工、能源及食品等领域。多粘类芽孢杆菌通过生物催化可实现2,3-丁二醇和乙偶姻之间的相互转化，乙偶姻和2,3-丁二醇二者之间的分配比例往往通过调节NADH/NAD⁺的比例实现。由于一分子2,3-丁二醇转化为乙偶姻过程需消耗一分子NAD⁺和一分子乙偶姻在转化为(R,R)-2,3-丁二醇的过程中需要消耗一分子NADH。因此，保证辅酶NADH和NAD⁺的充足有利于乙偶姻和2,3-丁二醇的积累。为实现这一目的，一方面研究者通过辅酶工程引入辅因子再生系统实现乙偶姻和2,3-丁二醇的分配比例的调节。另一方面，胞外氧化还原态势与胞内的NADH/NAD⁺密切相关，研究者通过外源添加氧化剂或还原剂(NaBH4、DTT、Vc)实现NADH/NAD⁺的调节进而实现乙偶姻和2,3-丁二醇的分配比例。由于构建辅酶再生系统本身复杂、实验周期长和外源添加增加发酵成本。

因此，亟需一种低成本的提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种低成本的利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：

将保藏编号为CGMCC NO.7096的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518种子按生物量0.1-0.4的接种密度接入发酵培养基中，在32～42℃、搅拌转速100～300rpm条件下培养10～15h，再接入高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02种子，继续发酵；所述保藏编号为CGMCC NO.7096的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518与高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的生物量比为1：1-4；

所述发酵培养基按g/L配方:葡萄糖30-50，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00。

本发明的优点：

本发明的方法既可以节约生产成本又可以提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量。

附图说明

图1为本发明的方法对乙偶姻产量的影响。

图2为本发明的方法对2,3-丁二醇产量的影响。

具体实施方式

本发明涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，命名为Paenibacillus polymyxa CJX-518。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号:CGMCC NO.7096。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2013年1月8日，并存活。以下将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CJX-518保藏编号为CGMCC NO.7096简称CJX-518。

各实施例的CJX-518种子是将CJX-518在CJX-518种子培养基培养获得。

CJX-518种子培养基(g/L)：葡萄糖5，淀粉30，酵母粉2，蛋白胨4，NaCl 0.5，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，pH自然，余量为水。

本发明涉及的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02(简称EC-Rib 02)是按天津大学于2015-12-29申请的中国专利申请号为2015110147666，发明名称为“一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法”公开的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib02构建方法构建的。

EC-Rib 02种子培养基(g/L)：LB培养基(胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10)

各实施例的EC-Rib 02种子是将EC-Rib 02在EC-Rib 02种子培养基培养获得。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：

实验组是将CJX-518种子按生物量0.1的接种密度接入发酵培养基中，在32℃、搅拌转速100rpm条件下培养10h，再接入EC-Rib 02种子，继续发酵；CJX-518与EC-Rib 02的生物量比为1：4；使接入CJX-518到发酵结束的总时间72小时，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的发酵液。

空白组为将CJX-518种子按生物量为0.1的接种密度接入发酵培养基中，在32℃、搅拌转速100rpm条件下发酵，使发酵的总时间72小时，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的发酵液。

实验组和空白组发酵培养基按g/L配方:葡萄糖30，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量为水。

实验组乙偶姻产量为6g/L，2,3-丁二醇产量为11g/L；空白组乙偶姻产量为4.9g/L，2，3-丁二醇产量为7g/L。

实施例2

一种利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：

实验组是将CJX-518种子按生物量0.2的接种密度接入发酵培养基中，在37℃、搅拌转速200rpm条件下培养12h，再接入EC-Rib 02种子，继续发酵；CJX-518与EC-Rib 02的生物量比为1：2，使接入CJX-518到发酵结束的总时间72小时，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的发酵液。

空白组为将CJX-518种子按生物量为0.2的接种密度接入发酵培养基中，在37℃、搅拌转速200rpm条件下发酵，使发酵的总时间72小时，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的发酵液。

实验组和空白组发酵培养基按g/L配方:葡萄糖40，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量为水。

实验组乙偶姻产量为7.3g/L，2,3-丁二醇产量为11.4g/L；空白组乙偶姻产量为5.2g/L，2，3-丁二醇产量为8.89g/L。

图1中：PP(PP为Paenibacillus polymyxa简写)为空白组；实验组为PP+E.coli。

图2中：PP(PP为Paenibacillus polymyxa简写)为空白组；实验组为PP+E.coli。

实施例3

一种利用混菌发酵提高乙偶姻和2,3-丁二醇产量的方法，包括如下步骤：

实验组是将CJX-518种子按生物量0.4的接种密度接入发酵培养基中，在42℃、搅拌转速300rpm条件下培养15h，再接入EC-Rib 02种子，继续发酵；所述CJX-518与EC-Rib 02的生物量比为1：1；使接入CJX-518到发酵结束的总时间72小时，得到含乙偶姻和2,3-丁二醇的的发酵液。

空白组为将CJX-518种子按生物量为0.4的接种密度接入发酵培养基中，在42℃、搅拌转速300rpm条件下发酵，使发酵的总时间72小时，得到含乙偶姻的发酵液和2,3-丁二醇的发酵液。

实验组和空白组发酵培养基按g/L配方:葡萄糖50，酵母粉1，蛋白胨10，NaCl 5，K₂HPO₄ 1，KCl 0.5,MgSO₄·7H₂O 0.7,FeSO₄·7H₂O 0.0003,MnSO₄·H₂O 0.005,pH 7.00，余量为水。

实验组乙偶姻产量为8.3g/L，2,3-丁二醇产量为10.4g/L；空白组乙偶姻产量为6g/L，2，3-丁二醇产量为8g/L。