一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法与流程

本发明属于生物能源领域，尤其涉及一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法。

背景技术：

合成气发酵产乙醇是以生物质为原料生产乙醇的一种新技术，即生物质完全气化得到CO、H₂、CO₂为主要成分的合成气，再利用微生物将合成气转化成乙醇。该技术不需要昂贵的酶和酸、碱等试剂，降低了生产成本，且理论上微生物可以完全利用气体，是一种环境友好型技术。

混合培养生物技术是近年来一个非常有前景的技术，其理念是从生物工程学的角度出发，结合环境生物技术的传统元素，在处理废弃物的同时又像工业生物技术那样使产品最大化。混合培养生物技术运用生态学的观点，通过选择或者调控压力对微生物进行生态调控。与基于纯培养的工业生物技术相比较，混合培养技术具有以下优点：(1)不需要灭菌；(2)微生物多样性带来的适应能力；(3)微生物利用混合基质的能力；(4)可持续过程的可能性。

合成气发酵产乙醇技术的研究在国内刚刚起步，由于CO、CO₂和H₂在液体中的溶解度很低，导致微生物对气体的吸收量少，存在乙醇产率较低等问题。目前国内外研究者采用了不同的调控手段来提高乙醇的产量，主要集中在对于发酵条件的调控，包括培养基的优化、pH的控制、气体传质效率的调控和气体组分及各组分气体分压的控制等。有学者发现酵母膏浓度对提高Clostridium autoethanogenum乙醇产率具有重要作用；有报道称低酵母提取物浓度有利于Clostridium ljungdahlii序批发酵提高乙醇与乙酸的摩尔比，研究表明不同的氮营养来源和氮营养物质的浓度都会在一定程度上影响产乙酸菌代谢产物乙酸和乙醇的浓度和比例。但这些报道都是基于酵母提取物对纯菌转化合成气产乙醇的影响研究，没有涉及混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法。

伊内奥斯生物股份有限公司发明的合成气发酵方法的操作方法(专利号CN104822836A)和合成气发酵中减少CO₂排放和提高醇生产率的方法(专利号CN104812904A)没有涉及基于氮缺陷调控方法的提高混合菌发酵合成气产乙醇的方法。中国科学技术大学提出的一种复合菌群及其在合成气发酵产醇中的应用(CN105087441A)也没有涉及氮缺陷调控方法。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法，使其更具有产业上的利用价值。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法，乙醇为产乙酸菌非生长偶联型产物，氮营养物质不足很可能导致细胞新陈代谢异常，从而导致细胞进入非生长状态或者休眠状态，通过氮营养缺陷来营造不利于产乙酸菌生长的条件，从而改变代谢途径从产酸相变化到产溶剂相，达到调控产乙醇的目的。

本发明提出一种混合菌发酵合成气产乙醇的氮缺陷调控方法，包括以下步骤：

第一阶段：培养混合菌在发酵培养基中生长至稳定状态，即发酵产物的产量稳定不变；

第二阶段：将所述第一阶段中生长至稳定状态的混合菌进行第二阶段的培养，控制该阶段的发酵培养基的氮浓度低于所述第一阶段；

所述混合菌为同型产乙酸菌，其来源包括牛粪、城市剩余污泥及其富集物。

进一步的，所述第一阶段和第二阶段中，发酵培养基包括氮源和基本成分，所述氮源包括酵母提取物或NH₄Cl，所述酵母提取物于第一阶段中的浓度为1.0～10.0g/L、第一阶段中的浓度>第二阶段中的浓度≥0.05g/L；所述NH₄Cl于第一阶段中的浓度为0.5～1.0g/L、第一阶段中的浓度>第二阶段中的浓度≥0g/L。

进一步的，所述基本成分包括K₂HPO₄ 0.25g/L、KH₂PO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 0.3g/L、BES 10.5g/L。

进一步的，所述第一阶段和第二阶段的培养过程中，充入合成气至标准大气压，所述合成气包括体积比为4:3:3的CO、CO₂、H₂。

进一步的，所述第一阶段和第二阶段的培养温度为30-55℃，pH为7.0-8.0。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明通过氮营养缺陷调控可达到提高混合菌合成气发酵的乙醇产量的目的，因为乙醇为产乙酸菌非生长偶联型产物，而氮营养物质不足很可能导致细胞新陈代谢异常，从而导致细胞进入非生长状态或者休眠状态，通过氮营养缺陷来营造不利于产乙酸菌生长的条件，从而改变代谢途径从产酸相变化到产溶剂相，达到调控产乙醇的目的；此方法可适用于木质素和纤维素等来源的合成气发酵，生产新能源乙醇使得废物资源化，并降低CO₂等温室气体的排放，符合可持续发展原则；这对合成气发酵产乙醇的大规模工业化应用提供了重要的理论价值和实际指导意义。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是实施例1中酵母提取物缺陷调控混合菌合成气发酵的乙醇产量；

图2是实施例2中NH₄Cl缺陷调控混合菌合成气发酵的乙醇产量；

图3是实施例3中酵母提取物缺陷调控混合菌合成气发酵的乙醇产量；

图4是实施例4中NH₄Cl缺陷调控混合菌合成气发酵的乙醇产量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

将50g同型产乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L酵母提取物的液体培养基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，调节pH＝7.0，37℃下进行第一阶段培养，待培养6天后同型产乙酸菌生长至稳定状态进入第二阶段。取10g第一阶段培养后的富集物接种至100mL含有0.05g/L酵母提取物的基础培养基中，置于37℃、100rpm恒温摇床上培养，培养基中基本元素的组分和浓度与第一阶段相同：K₂HPO₄ 0.25g/L、KH₂PO₄ 0.25g/L、MgCl₂·6H₂O 0.3g/L、BES(溴乙烷磺酸盐)10.5g/L。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，维持pH 7.0。利用气相色谱测量气体消耗情况和有机产物生成情况。结果表明，第二阶段乙醇积累量为12.6mmol/L，比第一阶段乙醇浓度高出58.3％(图1)。以上表明，控制第二阶段酵母提取物浓度低于第一阶段的两阶段培养法能够极大地提高乙醇产量。

同型乙酸菌的筛选方法如下：

接种200g牛粪于1000mL厌氧瓶，向其中加500mL成分为(L，pH 7)：CH₃COONa(3.5g)，NH₄Cl(0.5g)，KH₂PO₄(0.25g)，K₂HPO₄·3H₂O(0.25g)，MgCl₂·6H₂O(0.3g)，FeCl₃·6H₂O(25mg)，NiSO₄·6H₂O(16mg)，CaCl₂(25mg)，ZnCl₂(11.5mg)，CoCl·6H₂O(10.5mg)，CuCl₂·2H₂O(5mg)，MnCl₂·4H₂O(15mg)和BES(10.5g)的经厌氧处理的富集培养基。顶空充20min N₂(99％)至一个标准大气压，置于37℃、100rpm摇床上培养，每24h置换顶空气体。当fhs基因拷贝数上升并稳定时，富集结束，以此富集物为接种物，进行后续合成气生物转化实验。

实施例2

将50g同型产乙酸菌富集物加入到500mL含有0.5g/L NH₄Cl的液体培养基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，调节pH＝7.0，37℃下进行第一阶段培养，待培养6天后同型产乙酸菌生长至稳定状态进入第二阶段。取10g第一阶段培养后的富集物接种至100mL不含NH₄Cl的基础培养基(除氮源外其他基本组分及浓度同实施例1)中，置于37℃、100rpm恒温摇床上培养。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，维持pH 7.0。利用气相色谱测量气体消耗情况和有机产物生成情况。结果表明，第二阶段得到乙醇最大积累量为7.8mmol/L，比第一阶段最大乙醇积累量高出40.2％(图2)。以上表明，调控无机氮营养缺陷的两阶段培养法有利于乙醇的积累。

同型乙酸菌的筛选方法与实施例1相同。

实施例3

将50g同型产乙酸菌富集物加入到500mL含有10g/L酵母提取物的液体培养基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，调节pH＝7.0，37℃下进行第一阶段培养，待培养6天后同型产乙酸菌生长至稳定状态进入第二阶段。取10g第一阶段培养后的富集物接种至100mL含有0.1g/L酵母提取物的基础培养基中(基本元素组分和浓度同实施例1)，置于37℃、100rpm恒温摇床上培养。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，维持pH 7.0。利用气相色谱测量气体消耗情况和有机产物生成情况。结果表明，第二阶段乙醇积累量为10.9mmol/L，比第一阶段乙醇浓度高出45.9％(图3)。以上表明，控制第二阶段酵母提取物浓度低于第一阶段的两阶段培养法能够极大地提高乙醇产量。

同型乙酸菌的筛选方法与实施例1相同。

实施例4

将50g同型产乙酸菌富集物加入到500mL含有1.0g/L NH₄Cl的液体培养基中，充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，调节pH＝7.0，37℃下进行第一阶段培养，待培养6天后同型产乙酸菌生长至稳定状态进入第二阶段。取10g第一阶段培养后的富集物接种至100mL NH₄Cl浓度为0.25g/L的基础培养基(除氮源外其他组分及浓度同实施例1)中，置于37℃、100rpm恒温摇床上培养。充CO/CO₂/H₂(4:3:3)至一个标准大气压，维持pH 7.0。利用气相色谱测量气体消耗情况和有机产物生成情况。结果表明，第二阶段得到乙醇最大积累量为6.2mmol/L，比第一阶段最大乙醇积累量高出25.8％(图4)。以上表明，调控无机氮营养缺陷的两阶段培养法有利于乙醇的积累。

同型乙酸菌的筛选方法与实施例1相同。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。