一种鉴定冬虫夏草粉末混入发酵冬虫夏草菌粉的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药材的鉴定方法，具体来说，涉及一种鉴定冬虫夏草粉末中是否混入发酵冬虫夏草菌粉及初步判断混入比例的分析方法。
技术背景
[0002]冬虫夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.(又称冬虫草、中国虫草)是一种麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草生长于海拔3500?5000米的高原和高山地区，分布于我国四川、青海、西藏和云南等地，素与人参、鹿茸并称中国三大补药。冬虫夏草传统始载于《本草从新》，味甘、性温，入肺、肾经，有补肺肾、止嗽、益虚损、扶精气之功效。作为一味传统的名贵中药，它具有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种药理作用。现代医学用于治疗慢性肝炎、肾炎、支气管炎、冠心病、高血脂和肿瘤等，因其临床疗效确切而被广泛应用。近年来随着采挖力度的加大，资源日渐匮乏，价格也越来越昂贵。发酵冬虫夏草菌粉(发酵中华被毛孢菌丝体)是从冬虫夏草里分离出来的菌种进行发酵培养而得到，其化学成分和药理活性与冬虫夏草较类似，可作为一种冬虫夏草供不应求的替代品。但是其功效和价格都跟野生冬虫夏草有较大的差别。于是很多不法商贩为谋取暴利，在冬虫夏草中加入发酵冬虫夏草菌粉等类似品，以次充好、以假乱真、导致市场掺伪现象严重，伪品泛滥。
[0003]目前文献资料报道的冬虫夏草纯粉显微鉴定和红外鉴定能够有效的鉴别和区分冬虫夏草中是否混入了亚香棒虫草、凉山虫草等非正品虫草或者在其中掺入泥土、胶水、淀粉等，但是不能有效的鉴定冬虫夏草中是否混入了其类似物-发酵冬虫夏草菌粉。由于野生冬虫夏草与发酵冬虫夏草菌粉在化学成分上十分类似，薄层层析和高效液相色谱这些传统的方法也都很难鉴别冬虫夏草中混入低比例的发酵冬虫夏草菌粉。冬虫夏草市面上大量存在一些以冬虫夏草纯粉制作的片剂和胶囊，因此建立一种快速准确鉴别冬虫夏草纯粉中是否混入伪品和类似品的技术，对保证药材质量和规范市场次序有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004]针对现有鉴别技术存在的缺陷或不足，以及目前市面上销售的冬虫夏草纯粉胶囊和片剂中可能会掺入发酵冬虫夏草菌粉的质量问题，本发明的目的是提供一种冬虫夏草纯粉中是否混入一定比例的发酵冬虫夏草菌粉和初步判断混入比例的鉴别技术，可做定性定量分析。
[0005]具体的，本发明提供了一种冬虫夏草粉末混入发酵冬虫夏草菌粉的分析方法，由以下步骤组成:
[0006]I)取0.05g待测样品于1mL 30 %乙醇水溶液，401(氏频率超声提取25min，5000rpm离心lOmin，取上清液稀释4倍，0.45ym滤膜过滤，得到提取物；
[0007]2)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作为参比溶液，使用紫外分光光度计对步骤I)中的样品提取物进行紫外图谱扫描，其扫描范围为350-220nm，光谱分辨率为2nm ;
[0008]3)观察待测样品紫外扫描图谱是否在275-250nm波段内存在负的吸收值，若无负值，则表明冬虫夏草中混入了发酵冬虫夏草菌粉；若有负值，说明未混入10%以上质量比例的发酵冬虫夏草菌粉。
[0009]此外，本发明还可以通过在冬虫夏草纯粉样品中添加不同比例的发酵冬虫夏草菌粉标准品来建立模型图谱，通过比对标准图谱来对待测样品中混入的发酵冬虫夏草菌粉比例进行定量分析进行定量分析，具体的方法由以下步骤组成:
[0010]a)各取0.05g的待测样品、冬虫夏草纯粉样品、发酵冬虫夏草菌粉标准品和分别含有不同质量比例发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品置于1mL 30%乙醇水溶液中，40KHZ频率超声提取25min，5000rpm离心lOmin，取上清液稀释4倍，0.45 μ m滤膜过滤，得到各样品提取物；
[0011 ] b)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作为参比溶液，使用紫外分光光度计对步骤a)中的各样品提取物进行紫外图谱扫描，其扫描范围为350-220nm，光谱分辨率为2nm ;
[0012]c)将冬虫夏草纯粉样品，发酵冬虫夏草菌粉标准品和分别含有不同质量比例发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品的紫外扫描图谱进行叠加，建立标准模型图谱；
[0013]d)将待测样品紫外扫描图谱与步骤c)中模型图谱对比，根据图谱位置确定待测样品中混入发酵冬虫夏草菌粉的比例。
[0014]本发明方法的技术有益效果如下:
[0015](I)本方法需要样品量很小，鉴别快速准确，方便进行批量鉴定，经济适用性强。
[0016](2)样品不需要复杂处理，不需要大型精密仪器，对操作者技能无特殊要求。
[0017](3)本方法使用浓度为12.5 μ g/mL的腺苷作为参比溶液，能够通过观察在275-250nm段是否有负吸收值清晰直观的判断是否混入了 10%以上发酵冬虫夏草菌粉，与模型图谱比对能初步判断混入发酵中华被毛孢菌丝体的比例。
【附图说明】
[0018]图1是市售冬虫夏草胶囊样品A定性分析紫外吸收光谱图；
[0019]图2是市售冬虫夏草含片样品B定性分析紫外吸收光谱图；
[0020]图3是冬虫夏草样品(A)、分别混入10% (B) ,20% (C) ,40% (D) ,50% (E)发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品和发酵冬虫夏草菌粉标准品(F)紫外扫描图叠加建立的标准模型图谱。
【具体实施方式】
[0021]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例子仅为了阐明本发明，而非为了限制本发明的应用范围。
[0022]实施例1
[0023]取一份市售冬虫夏草胶囊样品A，将其中粉末取出进行研磨粉碎，过100目筛，然后称取0.050g样品置于10mL的圆底三角瓶中，加入30%乙醇水溶液10mL，40吗频率超声提取25min，5000rpm离心1min取上清液。将上清液取出后稀释4倍，使用0.45 ym微孔滤膜过滤，以12.5 μ g/mL腺苷标准品作为参比进行紫外光谱扫描，其扫描条件为:扫描范围350-220nm，光谱分辨率2nm。所得光谱图见图1。由样品的紫外吸收光谱图可以看出，在275-250nm波段内不存在负的吸收值，表明所售冬虫夏草胶囊中混入了发酵冬虫夏草菌粉。
[0024]实施例2
[0025]取一份市售冬虫夏草含片样品B，将其研磨粉碎，过100目筛，然后称取0.050g样品置于10mL的圆底三角瓶中，加入30%乙醇水溶液10mL，40KHz频率超声提取25min，5000rpm离心1min取上清液。将上清液取出后稀释4倍，使用0.45 μ m微孔滤膜过滤，以12.5 μ g/mL腺苷标准品作为参比进行紫外光谱扫描，其扫描条件为:扫描范围350-220nm，光谱分辨率2nm。所得光谱图见图2。由样品的紫外吸收光谱图可以看出，在275_250nm波段内有负的吸收值，表明所售冬虫夏草含片中未混入10%以上发酵冬虫夏草菌粉。
[0026]实施例3
[0027]取市售冬虫夏草胶囊样品A，从中国食品药品检定研宄院购买的野生冬虫夏草标准品和发酵冬虫夏草菌粉标准品和含有10 %、20 %、40 %、50 %发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草粉末7个样品，粉碎，分别过100目筛，然后各称取0.050g，分别置于10mL的圆底三角瓶中，各加入30%乙醇水溶液10mL，40KHZ频率超声提取25min，5000rpm离心1min取上清液。将上清液取出后稀释4倍，使用0.45 y m微孔滤膜过滤，以12.5 μ g/mL的腺苷标准品溶液作为参比，对以上7个样品分别进行紫外光谱扫描，其条件为:扫描范围350-220nm，光谱分辨率2nm。将野生冬虫夏草样品，发酵冬虫夏草菌粉标准品和含有10%、20%、40%、50%发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草所得紫外扫描图谱进行叠加建立紫外光谱标准模型图谱，见图3。将市售冬虫夏草胶囊样品与建立的紫外光谱标准模型图谱进行比对，根据其图谱中275-250nm处吸收值的位置，判断市售冬虫夏草胶囊样品中发酵冬虫夏草菌粉的比例为70-80%。
【主权项】
1.一种冬虫夏草粉末中混入发酵冬虫夏草菌粉的分析方法，其特征在于，由以下步骤组成: 1)取0.05g待测样品，加入1mL 30%乙醇水溶液，401(氏频率超声提取25min，5000rpm离心lOmin，取上清液稀释4倍，0.45ym滤膜过滤，得到提取物； 2)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作为参比溶液，使用紫外分光光度计对步骤I)中的样品提取物进行紫外图谱扫描，其扫描范围为350-220nm，光谱分辨率为2nm ; 3)观察待测样品紫外扫描图谱是否在275-250nm波段内存在负的吸收值，若无负值，则表明冬虫夏草中混入了发酵冬虫夏草菌粉；若有负值，说明未混入10%以上质量比例的发酵冬虫夏草菌粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还可以在冬虫夏草纯粉样品中添加不同比例的发酵冬虫夏草菌粉标准品来建立标准模型图谱，通过比对标准图谱来对待测样品中混入的发酵冬虫夏草菌粉比例进行定量分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，由以下步骤组成: a)各取0.05g的待测样品、冬虫夏草纯粉样品、发酵冬虫夏草菌粉标准品和分别含有不同质量比例发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品置于1mL 30%乙醇水溶液中，40KHZ频率超声提取25min，5000rpm离心lOmin，取上清液稀释4倍，0.45 μ m滤膜过滤，得到各样品提取物； b)以12.5 μ g/mL的腺苷溶液作为参比溶液，使用紫外分光光度计对步骤a)中的各样品提取物进行紫外图谱扫描，其扫描范围为350-220nm，光谱分辨率为2nm ； c)将冬虫夏草纯粉样品，发酵冬虫夏草菌粉标准品和分别含有不同质量比例发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品的紫外扫描图谱进行叠加，建立标准模型图谱； d)将待测样品紫外扫描图谱与步骤c)中模型图谱对比，根据图谱275-250nm处的位置确定待测样品中混入发酵冬虫夏草菌粉的比例。
【专利摘要】本发明涉及一种冬虫夏草粉末中是否混入发酵冬虫夏草菌粉和初步判断混入比例的紫外光谱分析鉴定方法。利用浓度为12.5μg/mL的腺苷溶液为参比溶液进行350-220nm的紫外光谱扫描。观察待测样品在275-250nm区段内是否存在负的吸收值即可判断是否混入了发酵冬虫夏草菌粉。将冬虫夏草纯粉样品，发酵冬虫夏草菌粉标准品和含有不同比例的发酵冬虫夏草菌粉标准品的冬虫夏草样品的扫描图谱叠加，建立标准模型图谱。将待测样品图谱与建立的模型图谱比对，可以初步判断混入发酵冬虫夏草菌粉的比例。本发明所述的鉴定方法对样品需求量很小，且操作简单，分析快速，易于操作，不需大型贵重仪器，鉴定结果准确可靠，能够进行批量鉴定。
【IPC分类】G01N21-33
【公开号】CN104568802
【申请号】CN201410856231
【发明人】李文佳, 艾中, 钱正明, 周建桥, 李文庆, 李光荣
【申请人】广东东阳光药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日