一种动脉粥样硬化抑制剂筛选方法的建立的制作方法

一种动脉粥样硬化抑制剂筛选方法的建立的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体设及一种动脉粥样硬化抑制剂的筛选方法。一种 血清淀粉样P蛋白（serum amyloid P component, SAP)及高密度脂蛋白（皿L)，建立SAP 与皿L结合的Elisa方法，并用此方法在FDA化合物库中筛选出了能够抑制SAP与皿L结 合的小分子化合物化t-3(Benserazide hy化ochloride-3)。
【背景技术】
[0002] 屯、血管疾病目前已成为严重威胁人类健康的一大杀手，而动脉粥样硬化 (atherosclerosis, A巧是众多屯、血管疾病中的一种，同时也是很多其他屯、脑血管疾病的病 理基础，它能引发血栓，屯、肌梗死，冠屯、病等，因此防治动脉粥样硬化发生和发展已成为当 前研究的热点。迄今为止，尚没有有效的抗动脉粥样硬化药物。因此对动脉粥样硬化机制 的深入研究及基于机制的抗动脉粥样硬化药物的开发对人类屯、血管健康具有重大意义。
[0003] 动脉粥样硬化的发生是基于多种因素的共同作用，而在众多因素中，血浆高密度 脂蛋白胆固醇（皿kC)是其中非常重要的一种。如何提高皿kC水平，直接影响到动脉粥 样硬化的防治效果。但皿L是一个大分子量的蛋白质，直接作为药物干预治疗，其静脉注射 量很大，长期大量注射很难实现，所W还没有被广泛应用，因此提高内源性皿L是防治As方 法中更有前途的方法。
[0004] 血清淀粉样P蛋白（serum amyloid P component, SAP)，主要由肝细胞合成。在 炎症刺激物的诱导下，比如脂多糖LPS、白介素IL-1、IL-6等，SAP的浓度会显著性升高，从 几倍到几百倍不等，提示SAP与屯、血管事件的潜在联系。研究发现临床动脉粥样硬化患者 的粥样斑块中有SAP,而且与AS的严重程度呈正相关，证明了 SAP与AS之间可能存在的联 系。
[000引 SAP被报道与皿L结合，SAP缺失后的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化症状减轻，而且 血清皿L浓度有显著提高。W上研究提示SAP促进动脉粥样硬化的形成。为此我们设计并 建立SAP与皿L结合的Elisa方法，并用此方法在FDA化合物库中筛选能够抑制SAP与皿L 结合的小分子化合物。此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研 究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。

【发明内容】

[0006] 采用实验室制备的SAP,进行生物素标记，获得SAP-Biotin。设计并建立SAP 与皿L结合的Elisa方法，并用此方法在抑A化合物库中筛选，Hit-3炬enserazide hy化ochloride-3)能够显著抑制SAP与皿L结合，且半数抑制浓度（IC5。）为4. 8 y M。
[0007] 下面是部分试验及结果：
[000引一、建立下列Elisa方法
[0009] W皿L包被ELISA板，4°C过夜，用封闭液封闭，37°C解育2h，加上述方法制备的 SAP-Biotin，37°C解育化后，加AB试剂，37°C解育比，加入TMB显色液，显色5?lOmin后 加终止液（2mol H2SO4)，酶标仪450nm测吸光度。根据有无皿L包被吸收值的差异，确定方 法的可行性。有无皿L包被吸收值有极显著性差异，说明Elisa方法建立成功。所有数据 统计学差异采用Student's t-test进行分析。P< 0.01为有极显著性差异。结果见表1。
[0010] 表1有无皿L包被吸收值（；± ??)
[0011]
【主权项】
1. 一种动脉粥样硬化抑制剂的筛选方法，主要包括以下步骤： 1. SAP制备及生物素连接 2. SAP与HDL结合Elisa方法的建立 3. FDA化合物库进行初步筛选 4) 小分子抑制剂的剂量依赖性测定。
2. 根据权利要求1所述的SAP及生物素连接，其特点在于：实验室制备SAP Iml (mg/ ml)，加 IOmM Sulfo-NHS-Biotin 66 μ 1，室温反应1小时，透析去掉未结合的生物素。
3. 根据权利要求1所述的Elisa方法，其特点在于：以100 μ 1/孔HDL(K) μ g/ml)包 被 ELISA 板，4°C 过夜；TBS/Ca/Triton 洗涤 3 次，用封闭液（1.5%BSA in TBS)封闭，37°C 孵育 2h ;TBS/Ca/Triton 洗涤 3 次，加 100 μ I SAP-Biotin，37°C孵育 2h ;TBS/Ca/Triton 洗 涤3次，加100 μ I AB试剂，37°C孵育Ih ;TBS/Ca/Triton洗涤3次，TBS/Ca洗涤3次，加入 100 μ I TMB显色液，显色5?IOmin后加50 μ 1终止液（2mol H2S04)，酶标仪450nm测吸 光度。
4. 根据权利要求1所述的初步筛选，其特点在于：筛选出候选化合物 Hit-3 (Benserazide hydrochloride)〇
5. 根据权利要求1所述的剂量依赖性测定，其特点在于：加入Hit-3的浓度分别为 0· 1 μ M，1 μ M，3 μ M，10 μ M 及 30 μ M0
【专利摘要】本发明公开了一种动脉粥样硬化抑制剂的筛选方法。实验室通过前期研究得到一种SAP，建立SAP-Biotin与HDL结合的Elisa方法，发明通过此方法在FDA化合物库中筛选出了能够抑制SAP与HDL结合的小分子化合物Hit-3(Benserazide hydrochloride-3)。此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。
【IPC分类】G01N21-31
【公开号】CN104568798
【申请号】CN201510043758
【发明人】何书英, 吴杰, 余新超, 耿建国
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月26日