专利名称：与再狭窄和动脉粥样硬化有关的基因的鉴定的制作方法
1.发明背景冠状动脉疾病是西方社会的一种地方性疾病。在该疾病中，向心肌供应血液的动脉由于脂肪、纤维化或钙化物质在动脉内部的沉积而变得狭窄。这些沉积的形成被称为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化减少了通向心脏的血流，使得心肌缺氧，导致心绞痛(胸痛)、或者心肌梗死(心脏病发作)、或者充血性心力衰竭。
一种通用的用于清理由于动脉粥样硬化引起阻塞的动脉的治疗方法是气球血管成形术，正式一些的叫法为“经皮冠脉腔内成形术”(PTCA)。该治疗方法通过插入一个充气膨胀的小气球，使其压缩和重排动脉壁上的阻塞斑，从而打开被阻塞的动脉。当使气球放气并移除后，动脉的内腔得以扩大，因此改善了血流状况。每年大约有一百万例血管成形术手术在进行。
在大量的血管成形术病人中，经治疗的动脉在六个月内再次发生狭窄，这一过程称为再狭窄。再狭窄在血管成形术后很快开始，其中血管内腔尺寸增加的部分(动脉内打开的通道)由于平滑肌细胞的增殖而逐渐被堵塞。大约20％-30％的血管成形术病人经历再狭窄，达到了使他们必须进行重复的血管成形术甚至是冠状搭桥(bypass)外科手术的程度。
再狭窄具有复杂的病理，在气球膨胀期间，它由血管壁的牵张诱导的损伤所激发。其刺激平滑肌细胞的迁移和增殖，从而导致新内膜(neointimal)积累(这构成再狭窄损伤)。其他促使再狭窄的过程包括炎症和胞外基质的积累。导致血管狭窄的血管壁重建是促成再狭窄的至关重要的因素。但是，这可以通过在血管成形术的位点安置预防血管重建的支架(stent)而得以完全消除。安装支架(Stenting)在很多医疗中心、在超过70％的血管成形术中几乎成为一种常规手段。当这些血管由于动脉粥样硬化而狭窄并经血管成形术治疗时，再狭窄也会发生在向腿部供应血液的动脉中。
通常，再狭窄通过显现狭窄的血管得以诊断，通过检测向血管注射的不透X线染料并完成电影脉搏描记图(血管造影术)。血管造影术是一种昂贵的侵入性技术，需要放射和特殊的装置以显现和解释其结果。典型性地，如果血管成形术被认为是成功的，则并不是由于维持了手术后血管内腔的增大，而是仅仅因为手术后的血管直径在6-8个月的疗程中其狭窄低于50％。
尽管一些因素看起来与再狭窄的发生相关，包括糖尿病、所进行治疗的次数、或者是支架(stent)在血管中的位置，但是目前还没有针对大量病人的可靠的、可预测的指示物用于指示受试病人是否处于再狭窄形成的高风险期。如果可以得到可靠的风险预测，将会对如何治疗病人产生重要的影响。对一些被认为面临发生再狭窄的高危病人可提供搭桥外科手术。其他人可以先进行血管成形术并且使用非常积极的医疗手段进行治疗。另一些人中，短距离放射治疗(血管内放射)可以被加入到一般的血管成形术中，该方法通常是为已被鉴定为面临再狭窄的高危病人保留的，更直接地估计-他们已经多处(multipleepisodes)发生再狭窄。因此，明显的，人们急切期盼一种新的、改进的用于检测和治疗再狭窄的方法。
最后，普遍共识的是再狭窄和动脉粥样硬化具有许多共同的和重叠的过程和机制，这两种情形的关键区别之一在于相关动脉的重要功能性狭窄的形成速度。因此，再狭窄可以被用作理解造成动脉粥样硬化的多种机制的有效模式。
II.发明概述因此，本发明的一个目的是提供预测再狭窄形成风险的方法。
本发明进一步的目的是提供治疗再狭窄和减少其复发的方法。
为了达到这些目的，提供了一种在哺乳动物中检测再狭窄的方法，包括测定来自哺乳动物样品中的至少三个基因的表达水平。再狭窄的存在通过样品中至少三个、五个、十个、二十个或五十个基因表达的增加或者通过样品中至少三个、五个、十个、二十个或五十个基因表达的减少得以指示。再狭窄的存在也可以通过样品中至少三个、五个、十个、二十个或五十个基因表达的改变(增加或减少)而得以指示。这些基因可以选自表1所列基因。
一种基因的基因表达的增加可以比参照水平至少高两倍、四倍、或十倍。一种基因的基因表达的降低可以是参照水平的至少二分之一或至少十分之一。
一种基因表达的改变，与参照水平相比，当增加时，可以比该基因的参照水平至少高两倍，当减少时，可以是该基因水平的二分之一。
在各种情况下，所说的参照水平可以是健康(未狭窄)血管组织的水平。换句话说，参照水平可以由狭窄前(pre-stenotic)水平确定。血管组织可以是血管动脉组织和/或血管静脉组织。样品也可以是血液和/或淋巴。
在其他实施方案中，测定方法是基因微阵列、定量PCR，和/或通过样品中的蛋白表达水平的测定。当测定蛋白表达时，一种或多种蛋白可能是可溶蛋白。蛋白表达水平可以通过ELISA确定。
根据本发明的另一个目的，本文还提供了一种抑制再狭窄的方法，所述方法包括给患有再狭窄的病人施用抑制平滑肌细胞增殖或新内膜增生的组合物，该组合物改变至少一种列于表1中的基因的表达。该组合物可以诱导改善再狭窄效果的基因表达或基因转录。该组合物可以抑制促进平滑肌细胞增殖和新内膜增生的基因。该组合物可以包括一个反义寡核苷酸序列和/或一个与mRNA结合形成三链体(triplex)的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中，组合物抑制至少一种促进平滑肌细胞增殖或新内膜增生的蛋白的活性。在另一个实施方案中，组合物包括结合于促进平滑肌细胞增殖或新内膜增生的蛋白的抗体。组合物可以包含人抗体、和/或可溶性蛋白受体。在另一个实施方案中，组合物包括用于施用的蛋白，该蛋白补充在再狭窄过程中蛋白减量调节导致的蛋白损失。
在进一步的实施方案中，检测通过使用适合于PCR的试剂盒进行，其中试剂盒包括特异于被表1所列基因鉴定的DNA或RNA序列的扩增的引物。
根据本发明的另一个目的，本文提供了一种用于评价个体中动脉粥样硬化或再狭窄形成风险的方法，该方法包括检测来自个体的样品中至少三个、五个、十个、二十个或五十个基因中生物学意义上重要(biologically important)的多态性的存在。这些基因可以选自表1所列基因。样品可以包括个体的淋巴、静脉或动脉血和/或血管组织。血管组织可以是血管动脉组织。
在一个实施方案中，多态性通过使用基因微阵列得以检测。在另一个实施方案中，多态性通过使用定量PCR得以检测。
根据本发明的另一个目的，本文提供了用于进行上述任意方法的试剂盒。
本发明的其他目的、特征和优点在下面的详细描述中显而易见。但是，应该理解，尽管指出了本发明的优选实施方案，详细的描述和具体的实施方案只是通过图例方式给出，因为对于本领域的技术人员来说根据本发明详细的描述，在其要旨和范围内各种变化和修改将是显而易见的。
附图
简述表1列出了在再狭窄形成过程中，其表达发生可检测到的改变的基因。
发明详述本发明提供用于预测、预防和治疗再狭窄和动脉粥样硬化的新的、改进的方法。在急性血管损伤的愈合反应过程中以及由此在再狭窄和动脉粥样硬化期间那些改变了表达水平的基因得以鉴定，并且基因表达的变化得以量化。在再狭窄过程中的不同时间点上，基因表达的相对变化得以测量，这些测定使得能够进一步地了解再狭窄的进展和形成。再者，通过测定基因表达的变化，使得再狭窄(或动脉粥样硬化)的风险性得以测定。
由于血管损伤的愈合反应涉及基因的差异表达，表达程度或者基因差异表达时间长度的变化导致异常的愈合模式。在血管壁损伤的前后效应中(或如再狭窄中的急性或如动脉粥样硬化中的慢性)，过度的愈合反应促成再狭窄或动脉粥样硬化的形成。基因表达程度或基因差异表达的时间长度的变化由基因中或者基因调控元件中的多态性引起的。因此，本发明鉴定那些其多态性能够传达再狭窄或动脉粥样硬化形成的易感性的基因。
鉴定与急性血管损伤的愈合反应相关的基因，使得那些部分由基因多态性引起的表达程度或持续时间发生变化的基因，被用作鉴定传递再狭窄或动脉粥样硬化风险性改变的遗传异常性的目标。与风险性增加相关联的多态性的鉴定使得可以在血管成形术程序进行之前对病人形成再狭窄的风险性进行预测，血管成形术程序前的风险性预测将对病人如何接受治疗产生重大的影响。对一些被认为具有非常高的再狭窄风险性的病人可提供旁外科手术。其他人可以先进行血管成形术并且被施以进攻性的医疗手段加以治疗。在其它一些人中，短程放射治疗(血管内放射)可以被加入到通常的血管成形术中，该方法通常是为已被鉴定处于再狭窄的高风险期的病人保留的，更直接地估计-他们已经具有多种再狭窄症状。因此，本发明提供新的、改进的预测再狭窄风险性的方法。
再者，鉴定在急性血管损伤的愈合反应中被激活的基因，为通过有目标的抑制那些适当的基因组或亚组的表达从而预防、改善或治疗疾病提供了新的方法。此外，本发明可以通过测定在治疗期间基因表达的变化，监控再狭窄治疗的有效性。
而且，再狭窄和动脉粥样硬化分享很多共同的和重叠的过程与机制。因此，许多在急性血管损伤的愈合反应中差异的表达基因与导致动脉粥样硬化的慢性血管损伤期间差异表达的基因相同。本发明因此可以在临床上明显的动脉粥样硬化实际发生之前；即可检测的或明显的相关心脏动脉或外周动脉狭窄的形成之前检测到具有动脉粥样硬化的个人的风险性特征。这些信息因此允许预防性地干预以防止动脉粥样硬化，并促进检测以延缓或改善疾病的进程。
本发明还允许分析鉴定基因的诱发动脉粥样硬化风险的多态性。由于不同的多态性在不同病人的动脉粥样硬化形成中的作用不同，本发明允许可能是具体病人的特征的特异性异常的鉴定。本发明因此考虑到更多的特异性治疗。对一个具有特异多态性特征的病人可能有效的治疗方案，在第二个具有不同多态性特征的病人身上可能无效。这种特征允许治疗被个性化，这样能够避免对具体病人无效的治疗策略的不必要的副作用。
具体的，大约两百个基因被鉴定，它们的表达在急性血管损伤愈合反应过程中发生变化，所述反应过程是导致再狭窄的内在过程。
由于在血管损伤的愈合反应中涉及这些基因的差异表达，表达程度上的变化或者差异表达时间长度上的变化可以导致异常的愈合模式。类似于瘢痕伤疤，其上的遗传预处理导致皮肤上过多的纤维性组织形成以响应皮肤的损伤。在血管壁损伤的前后效应中(如再狭窄中的急性或如动脉粥样硬化中的慢性)，过度的愈合反应促成再狭窄或动脉粥样硬化的形成。
基因表达程度上的变化或者基因差异表达时间长度上的变化能够通过基因或基因调节元件上的多态性引起。这种传递增长的疾病形成风险的多态性，已经通过与一些疾病相关的基因得以鉴定。因此，本发明鉴定那些其多态性能够传达再狭窄形成的易感性的基因。因此，随后的关于再狭窄(或动脉粥样硬化-见下)预测的参考文献，与通过本发明鉴定的基因或它们的调节单元的多态性相关。
再狭窄可以通过鉴定至少三个基因的多态性得以预测，这些基因的表达在急性血管损伤的愈合反应中是增量调节的。那些在急性血管损伤的愈合反应中至少三个减量调节的基因的多态性鉴定是可以用来预见再狭窄的。此外，至少三个基因的多态性鉴定，其中一些是增量调节的和一些是减量调节的，是再狭窄的预兆。进一步，一些基因的表达在急性血管损伤的愈合反应过程中被改变。
一些被鉴定基因的表达变化是可以预见的，不仅预见再狭窄本身的风险性，也诊断疾病的形成阶段。通过鉴定大约200个基因，其表达在急性血管损伤的愈合反应期间改变，并因此在再狭窄的形成过程中改变，发明人认识到那些基因的更多多态性分析导致预测再狭窄形成的能力、确定其形成的可能性的能力以及预测其最终严重性的能力大大提高。由于被鉴定的基因在再狭窄的病因学中可能起重要作用，操纵这些基因的表达的能力在再狭窄的治疗中可能是有效的。治疗再狭窄的方法可以包括基因疗法以增加疾病过程中减量调节基因的表达。治疗也可以包括在再狭窄过程中减少增量调节基因的表达的方法。减少基因表达的治疗可以包括但不限于，反义mRNA的表达，三链体的形成或者通过共表达抑制。
涉及再狭窄形成的基因的鉴定也使得可以影响再狭窄形成的蛋白的鉴别成为可能。这种蛋白的鉴定使得使用影响它们的表达或改变它们的代谢的方法成为可能。改变表达蛋白效果的方法包括但不限制于结合所鉴定蛋白的特异抗体或抗体片段的使用、结合所鉴定蛋白的特异受体的使用，或者从影响其生理对象、施加其代谢和生物学作用方面抑制所鉴定蛋白的其它配体或小分子的使用。此外，在再狭窄过程中那些减量调节的蛋白可以通过外因的补充以改善其合成的下降。
涉及再狭窄形成基因的鉴定使得预防地使用影响基因表达或者蛋白功能的方法成为可能。那些方法可以用于治疗在再狭窄形成风险中的个体。
不同的多态性可在不同病人的再狭窄形成过程中起作用。所以，本发明使得作为具体病人特征的特异异常性的鉴定成为可能，其考虑到治疗的更大特异性。对一个具有特异多态性特征的病人可能有效的治疗方案在第二个具有不同多态性特征的病人身上可能无效。那些特征允许治疗被个性化，这样能够避免对具体病人无效的治疗策略的不必要的副作用。
最后，再狭窄和动脉粥样硬化分享许多共同的、重叠的过程和机制。这两种病症的关键区别之一是相关动脉功能上重要的狭窄的形成速度。因此，再狭窄可用作理解造成动脉粥样硬化的多种机制的一种有效模式。所以，在这里公开的每一种方法可以用于预测动脉粥样硬化以及再狭窄的发生。类似的，在这里所公开的治疗方法可以用于治疗、预防和/或改善动脉粥样硬化以及再狭窄的症状。
再狭窄中基因表达变化的说明本发明人鉴定了在急性血管损伤的治愈反应过程中表达变化的基因，以及因此在再狭窄过程中发生变化的基因。那些基因列于表1。发明者使用如下更详细的描述对大鼠心脏组织进行了核酸排序分析。
大鼠是一种用于人血管研究的被广泛接受的模型，从大鼠中所获得的结果被认为是在人方面具有高度的可预见性结果。因此，人们希望，在急性血管损伤愈合反应期间人的基因表达的变化相似于或基本上相同于在大鼠中所观察到的结果。这些基因表达程度上的过度变化或者基因差异表达的时间长度上的过度变化将预示再狭窄。这种过度变化通常由基因或基因调节元件上的多态性引起，因此，在急性血管损伤愈合反应期间被认为是受到不同调节的大鼠基因将与那些其多态性被认为是传递了再狭窄的易感性的人的基因同源。再者，对于表1中所描述的每一种基因来说大鼠和人两者的同源性是已知的，进一步显示，在大鼠研究中所获得的结果将会在人中产生高的预见性结果。
由于再狭窄和动脉粥样硬化分享很多过程和机制，以及两者分享来自血管损伤的结果，在大鼠急性血管损伤愈合反应模型中被鉴定的异常表达的基因也将是易感动脉粥样硬化的异常表达的基因。特异异常性通过鉴定这些与动脉粥样硬化相联系的基因的多态性而确定。那些基因也作为治疗性干涉的靶目标-那些在急性血管损伤愈合反应期间增量调节的基因通过被设计用于降低基因表达或降低由这些基因编码的蛋白的功能的疗法而目标化(targeted)；那些在急性血管损伤愈合反应期间减量调节的基因可以通过被设计用于增加基因表达或增加编码这些基因的蛋白功能的疗法而目标化。
在实验诱导急性血管损伤期间大鼠颈动脉中基因表达的变化得以研究，模型通常被作为模拟在人中同样发生的再狭窄的合理的动物模型而被接受。获得样本和对照大鼠颈动脉组织，RNA从组织中制备，被标记的cRNA从中产生，使用Affymetrix Genechip大鼠基因组U34A组分析。样本和对照组织进行比较，并且那些在基因表达中经历明显变化的基因得以鉴定。为了这一研究目的，在基因表达中两倍的增加或者降低被认为是有显著的，尽管本领域的技术人员将认识到在某些环境中基因表达中的更小的变化也可以是显著的。与确定具有表达显著变化的各个基因相应的人类基因得以鉴定。
既然在急性血管损伤愈合反应过程里在表达中产生变化的基本上完整的一套基因得以鉴定，通过研究那些基因的更小的亚组的变化从而预测再狭窄和/或动脉粥样硬化形成的风险性是可能的。所以，尽管大约200个基因显示出在再狭窄中表达的改变，通过分析这些包含少至三个成员的基因亚组从而获得再狭窄风险性的可靠预测是有可能的。在其他实施方案中，至少五个、十个、十五、二十或者五十个基因可以被用于研究或者，如果希望，所有或者大部分列于表1的基因都能够被用于研究。再者，这些基因也能够被用于分析与再狭窄和动脉粥样硬化相联系的多态性。所有这些基因能够被用于最初的分析，而可靠的预测能够通过分析包含少至三个基因的基因亚组而获得。在其他实施方案中，至少三个、五个、十个、十五、二十或者五十个基因可以被用于研究或者，如果希望，全部或者大部分列于表1的基因能够被用于研究，例如，使用排序的、短的串联重复联合研究，单核苷酸多态性联合研究等等。但是，在各种情况下，通常更加便利的是研究更小的亚组基因的基因表达或者多态性。
通过测定一组基因的表达变化(或者通过鉴定影响基因组表达的多态性)，而不是单个基因，本发明提供了提高的统计学上的可信度观察到的变化可预测形成中的再狭窄和动脉粥样硬化的风险性--即提供可靠的个体风险性特征。从而单个基因表达上的变化，或者单个基因的多态性，可不增加对疾病的易感性，足以跨过疾病形成的阈值。另一方面，由于多重多态性的存在，多个特异基因表达的协同变化更加有可能增加再狭窄和动脉粥样硬化的风险性。这就类似于个体只有一个诱发动脉粥样硬化风险性因素的状态(增高的胆固醇)。随着风险因子数目的增加，风险性显著增加(增高的胆固醇加上高血压、肥胖、吸烟、糖尿病等等)。
通过测定基因表达和/或影响这些基因表达的多态性的存在，在进行血管成形术步骤之前预测再狭窄形成的风险性以及在临床上可检测得到的动脉粥样硬化形成之前预测动脉粥样硬化的风险性是可能的。这种早期预测提供给临床医生减缓或停止再狭窄或动脉粥样硬化形成的时机。进一步，本发明提供了能够用于抑制、减缓或预防再狭窄以及动脉粥样硬化的新组合物。
提高对再狭窄和动脉粥样硬化的易感性的多基因的调节异常导致基因表达中生物学意义上重要的过度变化的基因多态性能够直接在病人样本中测定，其表达的基因是在急性血管损伤愈合反应期间不同差异表达的基因，并且由此诱发再狭窄或动脉粥样硬化。这些样品包括最方便地从外周血中获得的DNA。本发明者使用核酸阵列方法鉴定一套完整的在急性血管损伤愈合反应期间显现明显表达变化的基因。但是，其他测定基因表达变化的方法在本领域中是已知。例如，蛋白水平能够使用定量免疫分析如ELASA在组织样本分离物中以测定。使用ELISA方法测定许多蛋白水平的试剂盒可以从供应者商业购得，如R&D系统(Minneapolis，MN)并且ELISA方法也能够使用已知的技术得以开发。例如参见抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual(Harlow and Lane Eds.Cold SpringHarbot Press))。那些用于ELISA方法中的抗体或者从商业上获得或者使用已知方法制备。
其他多蛋白定量分析方法包括，例如，proteomics技术如同位素编码的亲和标签试剂，MALDI TOF/TOF串联质谱，以及二维-凝胶/质谱技术。这些技术可以商业获得，例如从Large Scale Proteomics Inc(Germantown MD)以及Oxford Glycosystems(Oxford UK)。
可选地，定量mRNA扩增方法，例如定量RT-PCR，能够用于测定在信息水平基因表达的变化。进行这些方法的系统也可以从商业上获得，例如TaqMan系统(Roche Molecular系统，Alameda，CA)以及Light Cycler系统(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。设计用于RT-PCR的合适引物的方法以及相关方法是本领域已知的，尤其是，一些商业上可获得的软件包可用于设计PCR引物序列。
核酸阵列的提出提供了一种研究多基因表达的引人注目的方法。特别是，阵列为大量基因表达的同时测定提供了一种方法。这些方法现已为本领域所熟知，商品化的系统也是可以获得的。例如从Affymetrix(Santa Clara，CA)，Incyte(Palo Alto，CA)，Research Genetics(Huntsville，Al)以及Agilent(Palo Alto，CA)。也可参见美国专利5445934、5700637、6080585、6261776，它们由此被全部引入作为本文的参考。
基因表达程度的变化或者基因差异表达时间长度的变化可由基因或基因调节元件上的多态性引起。对于与一些疾病有关的基因，这种传递疾病形成增加的风险性的多态性已被鉴定。因此，本发明鉴定那些其多态性能够传递再狭窄或动脉粥样硬化形成的易感性的那些基因。
利用核酸阵列研究再狭窄中改变表达的一组基因，总RNA或mRNA样品从心脏组织获得，并使用本领域中已知的方法进行分析。例如，合适的心脏组织样品，如颈动脉，能够通过活组织检查获得。总RNA能够使用商业购买的试剂盒获得，例如Triazol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)以及mRNA能够通过在寡(dT)纤维素上层析从样品中获得。反转录RNA，得到的cDNA用于扩增的步骤。在一个实施方案中，扩增通过线性RNA扩增方法，像美国专利US5716785和5891636，它们由此被全部引入作为本文的参考。制备扩增的RNA的详细说明是可以获得的，例如，在使用AffymetrixGeneChip系统制备用于分析的样品的生产商的说明中。
一旦获得了合适的核酸样品，基因表达特征按照制造商的说明通过核酸阵列得以确定。在该样品中，它为阵列上的每一个基因探针提供了定量的基因表达水平。然后各个基因的表达水平与基准值进行比较以确定是否表达被改变了。因此，在研究中组织里的基因表达水平能够与在没有发生再狭窄的健康组织里的那些基因的参照水平进行比较。优选地，这些参照水平从同样的基因获得，尽管使用来自不同主体的参照水平是可能的。在这种情况下，优选的是使用来自尽可能与测试主体接近的主体的参照水平，例如，在人口统计学标准中的像年龄、性别、种族等。
尽管测定绝对的基因表达水平是有可能的，测定相对基因表达水平往往更为方便。因此，阵列上的具体基因的表达水平与相同阵列上的参照基因进行比较，参照基因的表达已知在再狭窄中不受影响，。例如，一种没有在表1中显示的基因。这为阵列提供了一种内在控制机制，降低了由于阵列、测定条件等的变异性导致的任何结果的差异。
在各种情况下，基因表达水平与适当的表达基准水平比较。表达基准水平是能够在健康血管组织中发现的水平，是先于血管成形术而测定的水平，从健康个体库中测定的整体浓度或其他一些客观基准。
鉴定基因多态性的方法在本领域中是已知的。例如，参见美国专利6235480和6268146，它们被引入作为参考。一旦多态性被鉴定，利用核酸阵列检测基因特异多态性的方法也是本领域中已知的。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中对选自表1所列基因中的至少三个基因的表达进行测定。这些基因能够以组合的方式选择，例如(i)所有三个基因表达的提高指示再狭窄；(ii)所有三个基因表达的降低指示再狭窄；(iii)一些基因表达下降与剩余的所选基因表达的提高相结合指示再狭窄，或(iv)在血管成形术初期或稍稍之后，一些基因表达的降低和其他一些基因表达的增加，随后那些减量调节基因表达的增加以及起初增量调节的基因表达的下降，指示再狭窄的形成。在本发明的其他实施方案中，至少5个基因或者至少大约5个基因的表达被测定以确定再狭窄的形成。在进一步的实施方案中被测定的基因数为10个。在其他实施方案中，被测定的基因数是20或者至少约为20。在其他实施方案中，被测定的基因数是50或至少约为50。不论被分析的基因亚组中基因数目多少，表达特征满足诊断上文陈述的疾病的标准，当(i)一些基因的表达在整个疾病过程中增加；(ii)一些基因的表达在整个疾病过程中下降；(iii)一些基因的表达增加，而其它基因的表达降低；或(iv)在疾病形成过程中一些基因的表达发生改变。
本发明还提供了一种方法，其中选自表1所列基因的至少三个基因的多态性的存在得以测定。然后多态性的合计数目能够用来提供再狭窄或动脉粥样硬化的风险性评价。有越多的具有生物学显著性的多态性存在，就有越大的风险性。由于更多的表1所列基因的多态性得以鉴定，甚至更大的风险性征兆将是可能的。因此，在本发明的其他实施方案中，至少五个基因或至少大约五个基因的表达被测定以确定再狭窄或动脉粥样硬化形成的风险性。在进一步的实施方案中被测定的基因数目是十。在其他实施方案中被测定的基因数目是20或至少大约是20。在其他实施方案中被测定的基因数目是50或至少大约50。
当基因的多态性集合数目列于表1时，这些基因以生物学显著性的方式过度基因表达并且诱发再狭窄或动脉粥样硬化的形成，则不论用于分析的基因亚组中基因数目的多少，多态性特征满足用以确定上文陈述的形成再狭窄或动脉粥样硬化的风险性的标准。本领域的技术人员将会认识到由于再狭窄和动脉粥样硬化的不同性质，并不是所有具有再狭窄或动脉粥样硬化的个体都将表现出表1所列出的每一种基因的改变的表达。因此，可能一种、几种或很多基因不表现出显著的改变的表达(并且由此将不包含具有生物学意义上重要的多态性)，并且不同的个体将表现出不同的多态性结合。但是，在所有基因的表达中，多态性诱导的协同变化对再狭窄和动脉粥样硬化的形成的存在具有高度的预见性。
概括地说，当对仅相对少量的基因表达进行研究时，必须观察大部分或者所有基因表达的变化以提供对再狭窄和动脉粥样硬化的可靠诊断。例如，当只有三个基因被测定时，所有三个基因必须显示表达中的相关变化以允许进行再狭窄和动脉粥样硬化的可靠诊断。当仅研究五个基因时，至少四个基因的典型变化将提供可靠的诊断。当十个基因被测定时，观察到至少七个基因变化时获得了可靠的诊断。当超过十个基因被测定时，被测定基因的90％、80％、70％、60％或50％变化可预测再狭窄和动脉粥样硬化。当这些百分比降低时，诊断的可靠性也下降，但是熟练的技术人员将认识到，当观察到表1所列基因中的20或30个基因表达的协同变化时，则具有高度的再狭窄预见性。一般地，随着基因数量的增加，通过观察被研究的相对较小的基因亚组中表达的协同变化来提供有效的诊断是可能的。
一般地，当仅研究相对少量的基因的生物学意义上重要的多态性时(导致诱发再狭窄或动脉粥样硬化)，必须观察大多数或者所有基因的多态性以提供可靠的形成再狭窄和动脉粥样硬化的风险性的评价。例如，当只有三个基因被测定，所有三个基因一定要显示相关多态性以允许进行再狭窄或动脉粥样硬化形成风险的可靠评价。当五个或者十个相关多态性得以鉴定，这种多态性的数目越多，个体形成再狭窄或动脉粥样硬化的评价的风险性就更大。本领域的技术人员将认识到，当在列于表1基因的20或30个基因的表达中观察到协同变化(作为生物学意义上重要的多态性结果)，则具有高度的再狭窄或动脉粥样硬化形成风险的预见性。
组织取样以确定改变的基因表达以及在相关基因表达中引起生物学意义上重要的改变的多态性的存在尽管包含核酸的任意样品适用于该目的，取样的最简单组织是外周静脉或动脉血。但是，组织像血管组织，尤其是动脉血管组织或静脉血管组织可以被使用。
改变的基因表达的意义术语增加的表达、降低的表达或者改变的表达意味着在所鉴定的基因中，与对照或非再狭窄动物中的基因表达相比，有至少两倍或者大约两倍的差别。基因表达的变化可以比参照水平高至少4倍或大约4倍。在其他实施方案中，基因表达的变化高于参照水平至少是十倍或大约十倍。因为一些被鉴定的基因是减量调节的，术语降低表达意味着在表达上那些基因与对照值相比降低了至少两倍或至少大约两倍。在其他实施方案中，术语降低的表达意味着在表达上那些基因与参照值相比降低了至少十倍降低或大约十倍。
参照水平的确定用于本发明方法中的参照水平是在相对健康血管组织中的基因表达水平。这可以意味着在狭窄前(pre-stenotic)组织的基因表达水平，或可以意味着在血管成形术之前基因表达的水平。参照水平可以通过由健康个体测定得来的整体值加以确定。
研究基因表达和列于表1的基因多态性的方法基因表达可以在核酸(RNA)水平或者蛋白水平进行研究。尽管每个细胞核携带完整一套基因，只有那些在每个细胞中表达的基因被转录成mRNA，mRNA然后被翻译成蛋白。因此，基因表达是组织或者甚至是细胞特异的。一般的，认为被转录的RNA分子数量越多，从中翻译成蛋白分子的数量越多。因此，使用RNA或者蛋白质分析获得的结果是相同的，至少根据基因表达水平的相对变化是相同的。因此，基因表达的分析可以通过具体的mRNA转录量或者由此翻译成的蛋白量指示。
多态性能够通过一些方法包括测序、短的串联重复结合研究、单核苷酸多态性结合研究等得以鉴定。这些方法在本领域中是已知的。
基因表达也能够在蛋白水平进行研究。尽管每个细胞核携带一整套基因，只有那些在每个细胞中表达的基因被转录成mRNA，mRNA然后被翻译成蛋白质。因此，基因表达是组织或者甚至是细胞特异的。一般的，认为被转录的RNA分子越多，从中翻译成蛋白分子的数量越多。因此，至少在基因表达水平的相对变化方面，使用蛋白分析获得的结果应是相同的。因此，基因表达的分析可以通过具体的mRNA转录量或者由此翻译成的蛋白量指示。但是，尽管基因多态性可以使用来自各种来源的组织包括外周血进行可靠地检测，用以确定基因表达水平相应变化的mRNA或者由表1所列任何基因编码的蛋白的测定精密地依赖于所采的组织样本。尽管对于一些发生在再狭窄或动脉粥样硬化形成位点的改变的基因表达的认识可以从采集和测定外周血样品获得，改变的基因表达的更可靠的评价从采集事实上形成再狭窄或动脉粥样硬化的动脉样品获得。
RNA表达从组织中分离RNA的方法在本领域中是已知的。例如，参见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(Third Edition)Cold spring Harbor Press，2001。也可使用商品试剂分离RNA。
简要地讲，例如，细胞或组织被溶解，溶解的细胞离心至移走细胞核沉淀。回收上清液并且用苯酚/氯仿抽提核酸，接着用乙醇沉淀。该方法提供能够通过260-280nM光密度定量测定的总RNA。
mRNA能够通过使用一些商品上可获得的试剂盒利用mRNA的“PolyA”尾从总RNA中分离获得。QIAGEN mRNA Midi试剂盒(Cat.No.70042)；Promaga PolyATtractmRNA分离系统(Cat.No.Z5200)。QIAGEN试剂盒提供了使用被设计用于分离polyA mRNA的Oligotex Resin的旋转柱(spin column)，在30分钟内从总RNA中获得了基本上纯的mRNA。Promega系统使用生物素化的寡dT探针与mRNA polyA尾杂交，需要大约45分钟分离并获得纯的mRNA。
还可以使用氯化铯垫层(cushion)梯度方法分离mRNA。简言之，如果瞬间冷冻组织在Guanethedium异硫氰酸盐中均化，在氯化铯垫上分层，并超离心24小时获得总RNA。
基因微阵列分析微阵列技术是鉴定单个mRNA样品中多基因表达的非常有效的方法。例如，从Affymetrix Inc.(Santa Clara，Ca)商业获得的基因芯片(Gene Chip)技术使用了由针对数以千计的已知基因和表达序列标签(ESTs)的探针铺敷的芯片。制备生物素化的cRNA(线性扩增的RNA)并与芯片上的探针杂交。然后显现互补序列并且信号的强度与由基因表达的mRNA的拷贝数量相当。
定量PCR
定量PCR(qPCR)利用靶序列与系列稀释的参照模板的共扩增。通过将靶定的扩增产物插入参照稀释物的曲线图，可以估计靶序列的浓度值。定量反转录PCR(RTPCR)可以使用试剂盒以及商业上可获得的方法在mRNA上进行。例如，Applied BioSystems(Foster City，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)。也参见Kochanowsi，“定量PCR方案”(Quantitative PCR Protocols)Humana Press，1999。例如，可以使用任意六聚体和TaqMan反转录试剂盒(Perkin Elmer)根据操作流程进行总RNA反转录。根据操作流程，使用包含AmpErase UNGdNTP、AmpliTaq Gold、引物以及TaqMan探针的TaqMan PCR主混合物扩增cDNA。TaqMan探针是靶基因序列特异的并且使用荧光报告基因(FAM)在5’末端标记并且在3’末端淬灭(举例来说，TAMRA)。可构建内源对照和靶基因两者的标准曲线图并且靶基因的CT(极限循环数量)比率同处理和未处理的细胞中对照的比较得以确定。该技术被广泛应用于描述基因表达的特征。
蛋白表达基因表达也可以在蛋白水平上研究。目标组织首先被分离，然后总蛋白通过已知的方法被抽提出来。
完成定量分析，例如，使用利用一对特异于靶蛋白的抗体的ELASA方法。
列于表1的蛋白亚组是可溶解或分泌的。在这种情况下，蛋白可以发现于血液、血浆或淋巴，那些蛋白的分析可以通过任意一种描述用于在这种组织中进行蛋白分析的方法获得。其提供了获得用于评价再狭窄和动脉粥样硬化形成风险性的病人样本的最低限度的侵入性方法。用于鉴别分泌蛋白的方法在本领域中是已知的。
再狭窄的治疗急性血管损伤的愈合反应期间，改变表达的一组基因的鉴定为治疗再狭窄和动脉粥样硬化提供了新的机会。急性血管损伤的愈合反应期间增量调节的基因的鉴定提供了使用负面影响它们的转录和翻译的方法的能力。类似的，在急性血管损伤的愈合反应过程中减量调节的基因的鉴定提供了正面影响它们的表达的能力。最后，这些基因编码的蛋白质的确定允许使用合适的方法改善和加强蛋白质的活性，因此能够影响再狭窄和动脉粥样硬化的形成。
增强基因表达的方法对于在急性血管损伤的愈合反应期间表现为表达下降的基因，通过增强一种或多种这些基因的表达从而改善或预防再狭窄或动脉粥样硬化是可能的。可以通过多种方式对基因转录进行有目的的修饰。例如，基因的外源拷贝可以通过同源重组以基因转导方式插入到血管组织的细胞基因组中。尽管通过基因转导方式获得的表达是相对稳定的，但表达也是低效率的。一种可选择的方法是基因被插入到载体中的瞬时转导方式，考虑到基因组等位基因的转录独立性，使用载体特异性启动子。尽管瞬时转导通常具有更高的表达，但是基因维持的时间周期很短，即使使用包含真核转录起始的游离型载体为载体提供更长的持续时间。还有另一种方法是用裸露DNA转染。但是，该方法通常导致极低的表达，并且DNA似乎被快速降解。
抑制基因表达的方法本发明提供一种对在急性血管损伤的愈合反应期间增量调节的基因表达产生负面影响的能力。减量调节基因的方法是已知的。已显示导入细胞的反义RNA将结合互补mRNA并由此抑制分子的翻译。以类似的方式，反义单链cDNA可以导入细胞，产生同样的结果。进一步的，因为异位整合的序列破坏内源基因的表达，可影响通过同源转基因的基因共抑制。(Cogoni等，Antonie van Leeuwenhoek，1994；65(3)205-9)，也可以导致反义RNA的转录(Hamada and Spanu，Mol.Gen Genet 1998)。最近报道了使用短的干扰RNA(RNAi)特异地抑制基因在真核细胞中的表达的方法。参见Tuschl等，Nature411494-498(2001)。
此外，稳定的三螺旋结构能够通过寡聚脱氧核糖核酸(ODNs)与双链DNA的多嘌呤区结合而形成。(例如，参见Rininsland，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 945854-5859(1997))。三链体的形成能够通过抑制转录延伸而抑制DNA复制并且它是非常稳定的分子。
抑制特异蛋白活性的方法当特异蛋白被牵连在再狭窄和动脉粥样硬化的路径中，其活性可以通过几种方法改变。首先，可使用特异型抗体与蛋白结合，而阻碍其活性。这种抗体可以通过常规的杂交技术获得或者可以从商业购得的文库中分离获得，所述文库购自Dyax(Cambridge，MA)，MorphoSys(Martinsried，Germany)，Biosite(San Diego，CA)和CambridgeAntibody Techmology(Cambridge，UK)。此外，蛋白通常通过连接到细胞受体而发挥其细胞作用。识别受体与本发明所包含的促成再狭窄和动脉粥样硬化的蛋白结合，允许特异配体拮抗物的设计，该拮抗物阻断调节导致再狭窄和动脉粥样硬化形成的作用的通路。
急性血管损伤愈合反应期间减量调节的基因的鉴定导致鉴定其蛋白产物的能力，减量调节蛋白然后被补充，由此改善其降低合成的作用。
可预防性地使用本发明的方法以防止处在风险中的个体形成再狭窄和动脉粥样硬化。
本发明还提供了具有芯片的试剂盒，该芯片包含对表1中鉴定的基因有生物学意义上重要的多态性的DNA(DNA of the biologicallyimportant polymorphisms for the genes identified in Table 1)。这种芯片允许多态性的快速检测，提供快速检测那些处于再狭窄或动脉粥样硬化形成的低或高风险中的个体的便利方法。在具体的病人中，特异多态性的检测将允许对各个病人设计高度特异性和个性化的治疗方案，以预防或削弱再狭窄或动脉粥样硬化。
这样一般描述的本发明，将通过参考如下的实施例更容易地理解，这些实施例以图例的方式提供，并无意于限制本发明。
实施例颈动脉再狭窄的微阵列分析RNA的分离大鼠被分成两组。一种使用颈动脉血管成形术治疗，对照组通过假外科手术治疗。外科手术和假外科手术之后大鼠颈动脉被收集并被瞬时冷冻。合并的颈动脉(30-50mg)用研钵和杵研磨成粉末(用液氮收集)然后在2.5ml异硫氰酸胍中均化。4℃下，使用氯化铯垫层梯度超速离心24小时抽提总RNA。参见上文Sambrook等。
靶物制备和DNA微阵列杂交对于第一链cDNA合成反应，5.0-8.0μg总RNA用T7-(dT)24引物在70℃下孵育10分钟，然后置于冰上。对于温度调节步骤，加入5倍第一链cDNA缓冲液、0.1M DTT、和10mM dNTP混合物，该反应在42℃温度下孵育1小时。SSII反转录被加入，该反应在42℃温度下孵育1小时。随着第一链合成的完成，5X第二链反应缓冲液，10mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP、DNA连接酶、DNA聚合酶I以及RNaseH被加入到反应试管中。样本在16℃中孵育。加入0.5M的EDTA后，使用锁相凝胶-苯酚/氯仿抽提清洗cDNA，随后乙醇沉淀。
生物素标记的cRNA的合成(体外转录)使用购自(ENZO Biochem，Inc.，New York，NY)的ENZO BioArrayRNA转录标记试剂盒，根据厂商手册完成生物素标记的cRNA的合成。为了建立反应，1μg的cDNA、10倍HY反应缓冲液、10倍的生物素标记核苷酸、10倍DTT、10倍RNA酶抑制剂混合物以及20倍T7 RNA聚合酶在37℃温度下孵育4-5小时。使用购自QIAGEN的RNeasy旋转柱纯化标记的RNA，随后乙醇沉淀并定量。
用于靶物制备的cRNA片段片段将5倍的片段缓冲液(200m Tris-醋酸，pH 8.1，500mM KOAc，150mM Mg)Ac)加入cRNA。样品在94℃温度下孵育35分钟，然后置于冰上。片段化的cRNA储存在-70℃。
靶物杂交杂交混合物制备如下片段化的cDNA(调成15μg)、对照寡核苷酸B2(Affymetrix)、20倍真核杂交对照(Affymetrix)、鲱精DNA、乙酰化BSA、2倍杂交缓冲液(Affymetrix)混合，加热至99℃5分钟。
杂交混合物然后以最大速度离心5分钟以从混合物中除去任何不溶物质。离心后，混合物在45℃加热5分钟。然后将澄清的杂交混合物加入Affymetrix U34A探针阵列柱体，该柱体用1倍的杂交缓冲液预湿。然后将探针阵列置于设定在60rpm的45℃烘箱炉中杂交16小时。
冲洗、染色和扫描探针阵列GeneChipFluidics Station 400被用于洗涤和染色该阵列。该装置使用GeneChip软件运行。简言之，阵列用非严格洗涤缓冲液在25℃下洗涤10个循环，接下来用严格洗涤缓冲液50℃洗涤4个循环。然后该阵列用藻红蛋白链霉胍在25℃下染色10分钟。然后用非严格洗涤缓冲液在25℃下洗涤10个循环。该探针阵列用藻红蛋白链霉胍在25℃下染色10分钟，然后用非严格洗涤缓冲液在30℃下洗涤15个循环。通过将探针阵列置于HP Gene ArrayTM扫描仪中检测杂交信号，该扫描仪用GeneChip软件操纵。
数据分析根据厂商说明使用GeneChip软件(3.3版)进行数据分析。Lockhart，D.J.等，Nat.Biptechnol.141675-80(1996)。简言之，每个基因通过芯片上的1-3个探针组得到描述和分析。每个探针组包括16个最佳匹配(PM)和16个错配(MM)的25个核苷酸碱基探针。错配在25个碱基对探针中具有单个碱基变化。比较了来自PM和MM探针的杂交信号，这使之可以测定特异性的信号强度，并从两个对照芯片中的消除非特异性杂交。每个探针对的强度差别以及强度比率被用于“存在”或“缺失”的命名。对照被用做基线，并且用于实验的GeneChip测定值与基线比较得出4个矩阵(matrixes)，该矩阵用于确定显示具体基因的转录水平是否改变的不同命名。
使用电子制表软件分析(Microsoft Excel)进行重复的比较。每个实验数据在特定时间点设定，测定各个基因的对照和试验之间表达的差异。与所有四对比较交叉的具有一致差异的基因被提出用于进一步分析。
GeneSpring分析将从每个GeneChip测定获得的数据加入GeneSpring软件，并分析基于瞬时表达特征收集的基因。0.97或者更高的相关系数被视为建立具有显著表达同源性的基因簇的界限。
本申请要求美国申请60326210的优先权，其全文被引入作为参考。
权利要求
1.一种在哺乳动物中检测再狭窄的方法，包括测定来自所述哺乳动物样品中至少三个基因的表达水平。
2.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少三个基因的增加的表达显示。
3.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少五个基因的增加的表达显示。
4.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少十个基因的增加的表达显示。
5.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少二十个基因的增加的表达显示。
6.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少三个基因降低的表达显示。
7.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少五个基因的降低的表达显示。
8.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少十个基因的降低的表达显示。
9.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少二十个基因的降低的表达显示。
10.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少三个基因的改变的表达显示。
11.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少五个基因的改变的表达显示。
12.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少十个基因的改变的表达显示。
13.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少二十个基因的改变的表达显示。
14.根据权利要求1的方法，其中再狭窄的存在通过在所述样品中至少五十个基因的改变的表达显示。
15.根据任一权利要求1-14的方法，其中所述基因选自表1所列的基因。
16.根据任一权利要求1-14的方法，其中所述样品包括所述哺乳动物的血管组织。
17.根据权利要求1-16的方法，其中所述血管组织是血管动脉组织。
18.根据权利要求1-16的方法，其中所述血管组织是血管静脉组织。
19.根据权利要求2-5任一项的方法，其中所述增加的表达比参照水平至少高两倍。
20.根据权利要求2-5任一项的方法，其中所述增加的表达比参照水平至少高四倍。
21.根据权利要求2-5任一项的方法，其中所述增加的表达比参照水平至少高十倍。
22.根据权利要求6-9任一项的方法，其中所述降低的表达至少是参照水平的一半。
23.根据权利要求6-9任一项的方法，其中所述降低的表达至少是参照水平的十分之一。
24.根据权利要求10-14任一项的方法，其中所述改变的表达，当增加时，比该基因的参照水平至少高两倍，当降低时，与参照水平相比是该基因水平的一半。
25.根据权利要求19-24任一项的方法，其中所述的参照水平是健康血管组织中的水平。
26.根据权利要求19-24任一项的方法，其中所述的参照水平由狭窄前的水平确定。
27.根据权利要求1的方法，其中测定方法是基因微阵列。
28.根据权利要求1的方法，其中测定方法是定量PCR。
29.根据权利要求1-24任一项的方法，其中基因表达的水平通过测定样品中蛋白质表达水平而确定。
30.根据权利要求29的方法，其中所述蛋白是可溶蛋白。
31.根据权利要求29的方法，其中所述样品是血液。
32.根据权利要求29的方法，其中所述样品是淋巴。
33.根据权利要求29的方法，其中蛋白表达水平通过ELISA确定。
34.一种抑制再狭窄的方法，包括给患有再狭窄的病人施用抑制平滑肌细胞增殖或者新内膜增生的组合物，其中所述组合物改变了表1所列的至少一种基因的表达。
35.根据权利要求34的方法，其中所述组合物诱导改善再狭窄作用的基因的表达或者基因转录。
36.根据权利要求34的方法，其中所述组合物抑制促进平滑肌细胞增殖或者新内膜增生的基因。
37.根据权利要求34的方法，其中所述组合物包括反义寡核苷酸。
38.根据权利要求34的方法，其中所述组合物包括与mRNA结合形成三链体的寡核苷酸。
39.根据权利要求34的方法，其中所述组合物抑制至少一种促进平滑肌细胞增殖或者新内膜增生的蛋白的活性。
40.根据权利要求34的方法，其中所述组合物包括与促进平滑肌细胞增殖或者新内膜增生的蛋白结合的抗体。
41.根据权利要求40的方法，其中所述组合物包括人抗体。
42.根据权利要求34的方法，其中所述组合物包括可溶蛋白受体。
43.根据权利要求34的方法，其中所述组合物包括一种蛋白，施用该蛋白可以补充在再狭窄过程中减量调节的蛋白的损失。
44.根据权利要求1的方法，其中检测使用适于PCR的试剂盒进行，并且所述试剂盒包括特异于由表1所列基因鉴别的DNA或RNA序列扩增的引物。
45.一种评价个体中再狭窄或动脉粥样硬化形成风险性的方法，包括检测从所述个体获得的样品中的至少三个基因的生物学意义上重要的多态性的存在。
46.根据权利要求45的方法，包括检测从所述个体获得的样品中的至少五个基因的生物学意义上重要的多态性的存在。
47.根据权利要求45的方法，包括检测从所述个体获得的样品中的至少十个基因的生物学意义上重要的多态性的存在。
48.根据权利要求45的方法，包括检测从所述个体获得的样品中的至少五十个基因的生物学意义上重要的多态性的存在。
49.根据权利要求45-48任一项的方法，其中所述基因选自表1所列基因。
50.根据权利要求45-49任一项的方法，其中所述样品包括所述个体的动脉或静脉血。
51.根据权利要求45-49任一项的方法，其中所述样品包括所述个体的血管组织。
52.根据权利要求51的方法，其中所述血管组织是血管动脉组织。
53.根据权利要求45的方法，其中所述多态性通过基因微阵列检测。
54.根据权利要求45的方法，其中所述多态性通过定量PCR检测。
55.根据权利要求45-49任一项的方法，其中所述样品是血液。
56.根据权利要求45-49任一项的方法，其中所述样品是淋巴。
57.根据权利要求45-56任一项的方法，其中检测使用适于检测表1中所列基因的生物学意义上显著的多态性的试剂盒进行。
全文摘要
本发明提供了在个体中评估形成再狭窄或动脉粥样硬化的风险的方法。还提供了治疗或预防再狭窄或动脉粥样硬化的方法和组合物。
文档编号G01N33/68GK1599799SQ02824192
公开日2005年3月23日 申请日期2002年10月2日 优先权日2001年10月2日
发明者S·E·埃普斯泰因, S·杜尔拉尼 申请人:医疗星研究院