专利名称：抗动脉粥样硬化的黑三棱内酯b化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中医药技术领域，具体地说是涉及一种从中药三棱中分离得到的具有 抗动脉粥样硬化活性的新化合物黑三棱内酯Wsparstolenin B)以及该化合物的制备方法。
背景技术：
动脉粥样硬化(AS)是缺血性心脑血管疾病的病理和病理生理基础，与多种疾 病的发生都有关，AS累及全身重要器官的动脉血管，导致组织的缺血和坏死，产生致残或 致死的严重后果，是中老年人最常见的疾病之一。研究动脉粥样硬化的药物防治始终是 医学领域的热点。中药三棱系黑三棱科黑三棱属植物黑三棱(Sparganiumstoleniferum Buch-Ham)的干燥块茎，具有破血行气、消积止痛的功效，临床常用于治疗中风、冠心病、心 绞痛、肿瘤、产后瘀血、盆腔炎等症。目前已知从三棱中分离出黄酮类、留体、三萜、有机酸等 成分(董学等。齐鲁药事，2005，24 (10)，612)。于永红等报道三棱对家兔实验性AS病灶具 有明显的消退作用，同时还抑制原癌基因C-myc，C-fos, V-sis表达；三棱提取物还能抑制 兔动脉平滑肌细胞增殖，提示三棱可用于防治AS和经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄(于 永红等。湖北民族学院学报 医学版，2001，18⑵，4;于永红等。湖北民族学院学报 医学 版，1999，16(2)，1)。叶兰等报道三棱可抑制大鼠海绵内新生肉芽组织的血管新生，有抗血 管生成作用，同时三棱含药血清也可抑制血管内皮生长因子诱导的血管内皮细胞增殖，为 三棱治疗病理性血管增生疾病(如肿瘤、AS、子宫内膜异位症等)提供了一定的科学依据 (叶兰等·中国药房，2008，19 (21)，1610 ；叶兰等，第三军医大学学报，2007，29 (2)，121)。邓 英君报道三棱不同提取物能延长小鼠凝血时间，还有显著的镇痛抗炎作用(邓英君。时珍 国医国药，1999,10(12) 882-883)；和岚等报道三棱能显著降低全血黏度，具有抗血小板 活化作用(和岚等。山东中医药大学学报，2007，31(5)，434)。董学等首次报道三棱中还含 有氧杂蒽类化合物三棱双苯内酯(sanleng diphenyllactone)(董学等。药学学报，2008， 43 (1)，63)，但三棱中氧杂蒽类化合物的活性未见报道，三棱抗动脉粥样硬化的活性成分未 见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗动脉粥样硬化的黑三棱内酯B化合物及其该化合 物的制备方法。一种黑三棱内酯Bkparstolenin B)化合物，其特征在于该化合物的化学结构式
如下
棱内酯B为黄色针晶(石油醚-乙酸乙酯)，熔点258 259°C，分子式为 :(MeOH) :288. 5，352. 5，386. 0(sh)nm ；高分辨电喷雾离子质谱(HRESI-MS) 269. 04492 [M+H] + (cal. 269. 04445) ； IR (KBr) cm-1 3419 (OH), 1690 (C = 0)，1633(双键)， 1486,1463,1331,1226,1158,1098,816 ；1HNMR(300Hz,DMS0-d6,ppm, J in Hz) δ :10. 34(1Η, s，7-0H)，9. 50 (1H, s，2_0H)，7. 92 (1H, s, 11-H)，7. 43 (1H, d, J = 9. 0Hz，5_H)，7. 06 (1H, d, J = 2. 7Hz, 1-H) ,7. 03 (1H, d, J = 9. 0Hz，6_H)，6. 98 (1H，d, J = 9. 0Hz，4_H)，6. 80 (1H， dd, J = 9. 0,2. 7Hz,3-H) ； 13CNMR(75MHz, DMS0_d6，ppm) δ : 107. 70 (C_l)，153. 83 (C_2)， 118. 19(C-3) ,118. 24(C_4)，123. 55(C_5)，140. 60 (C_5a)，117. 22 (C_6)，155. 05 (C_7)， 104. 71 (C-8)，119. 84 (C_8a)，114. 62 (C_9)，109. 56 (C_9a)，142. 84 (C-IOa)，134. 93 (C_l 1)， 163. 99(C-12)。该化合物具有独特的结构骨架，属于氧杂蒽类，是一个新化合物。本发明黑三棱内酯B化合物的制备方法，其制备步骤如下(1)提取取黑三棱的干燥块茎，粉碎，用乙醇水溶液浸泡2天，再用乙醇水溶液加 热回流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩至无醇味。(2)分离将上述浓缩液加1倍水稀释成混悬液，再分别以石油醚，乙酸乙酯，正丁 醇萃取，乙酸乙酯萃取液合并浓缩后，用硅胶柱层析纯化，以石油醚乙酸乙酯梯度洗脱， 薄层层析检查，收集含黑三棱内酯B的流分，合并浓缩后再经硅胶柱层析，以石油醚_乙酸 乙酯梯度洗脱，薄层层析检查，得到黑三棱内酯B纯品。上述步骤(1)中所述的乙醇水溶液为70% 95%。上述步骤(2)中用硅胶柱层析，先以石油醚乙酸乙酯=100 70 0 30梯 度洗脱，然后以石油醚-乙酸乙酯=98 80 2 20的梯度洗脱。上述的黑三棱内酯B化合物在制备治疗和预防动脉粥样硬化疾病药物中的应用。本发明黑三棱内酯B化合物的抗动脉粥样硬化的药理活性研究结果。在动脉粥样 硬化的发病过程中，动脉的中膜平滑肌细胞向内膜迁移和过度增殖是动脉粥样硬化主要原 因；氧自由基能对低密度脂蛋白(LDL)进行氧化修饰，修饰的LDL(oxLDL)有细胞毒性，抑制 LDL与其受体结合，使LDL不能被清除而沉积在动脉内壁下，还损伤血管内皮细胞，造成血 管平滑肌细胞过度增殖，最后导致动脉粥样硬化的发生和发展。通过药理实验表明，黑三棱 内酯B能抑制动脉平滑肌细胞迁移，抑制由巨噬细胞介导的LDL的氧化，以及能抑制由ADP 诱导的兔血小板聚集。表明黑三棱内酯B具有一定的抗动脉粥样硬化作用。表1.黑三棱内酯B对动脉平滑肌细胞迁移的抑制作用 *p < 0. OOOlvs 空白对照组表2.黑三棱内酯B对巨噬细胞介导的LDL氧化的抑制作用 *p < 0. OOOlvs 空白对照.表3.黑三棱内酯B对ADP诱导兔血小板聚集的作用 *ρ < 0. 05,**ρ < 0. Olvs 空白对照.
具体实施例方式实施例1黑三棱内酯Bkparstolenin B)化合物的提取分离方法取购自浙江的黑三棱(Sparganium stoleniferum)干燥块茎18Kg，粉碎，用85% 的乙醇水溶液浸泡2天后，用85%乙醇水溶液加热回流提取三次，合并三次提取液，减压浓 缩至无醇味，浓缩液加1倍水稀释成混悬液，再分别以石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸 乙酯萃取液合并浓缩得浸膏60. 5克，将浸膏进行硅胶柱(200 300目)层析，以石油醚乙酸乙酯梯度(100 0,99 1,98 2,96 4…，70 30)洗脱，薄层层析检查，收集含 黑三棱内酯Wsparstolenin B)的流分，合并浓缩后再经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯 梯度(98 2,95 5…，80 20)洗脱，薄层层析检查，得到黑三棱内酯B纯品。实施例2黑三棱内酯B对动脉平滑肌细胞迁移的抑制作用(scratch assay (Chun-ChiLiang,Ann Y Park & Jun-Lin Guan. Nature Protocols,2007，2 (2)，329))将IX IO6大鼠动脉平滑肌细胞接种于培养皿内，用含10% FBS的DMEM培养基培 养24h，去除培养基，再用不含血清的DMEM培养24h。用200 μ L移液管尖端在细胞上刮出 一条直线，使细胞间产生一条刮痕，用DMEM洗细胞两次。加入新鲜的含0. 5% FBS的DMEM 培养基，同时加入不同浓度的黑三棱内酯B使终浓度分别为10、20和50yg/ml，并设空白对 照，每个组设4复孔，在37°C，5% CO2条件下继续培养48h后，拍照，测量细胞迁移距离，计 算平均迁移距离并用Prism软件对数据进行t检验，空白对照组和各浓度组的细胞平均迁 移距离分别为 0. 796士0. 021,0. 546士0. 057 和 0. 342士0. 035，空白对照为 0. 967士0. 027， 按照公式计算药物抑制率(％)=(空白对照组迁移距离-药物组迁移距离)/(空白对照 组迁移距离)X 100%，分别为17. 68%,43. 54%和64. 63%实施例3黑三棱内酯B对巨噬细胞介导的LDL氧化的抑制作用将IXlO6THP-I细胞接种于含24孔培养皿中，加入含20ng/ml TPA (12-0-tetra decanoylphorbol-13-acetate)的 RPMI-1640 培养基，在 37°C，5% CO2 条件下培养 72 小 时。弃去培养液，用RPMI-1640洗涤两次，加入含100 μ g/ml人低密度脂蛋白(LDL)和1 μ M CuSO4的新鲜培养基500 μ 1，同时加入不同浓度的黑三棱内酯B使终浓度分别为10、20和 50 μ g/ml并设空白对照组，每个组设6复孔，继续培养4h。收集细胞培养液并离心，取上 清液100 μ 1，用TBA比色法分析，酶标仪535nm波长下测定OD值，计算MDA (丙二醛)浓 度以示LDL氧化程度，用Prism软件对数据进行t检验，平均MDA值分别为10. 22士0. 64、 9. 32 士 0. 57和7. 12 士 0. 78 μ M，按公式计算抑制率(%)=(空白对照组MDA-药物组MDA) / (空白对照组 MDA) X 100%，分别为 21. 08，28. 03 和 45. 02%实施例4黑三棱内酯B对ADP诱导兔血小板聚集的作用取雄性新西兰家兔，体重2. 2-2. 5kg。仰卧位固定于家兔手术台上，剪去颈部兔毛， 皮下注射盐酸普鲁卡因注射液局部浸润麻醉。剪开颈部皮肤约3cm，用止血钳进行钝性 分离，暴露支气管后分离出颈总动脉。细线结扎颈总动脉远心端，再用动脉夹夹闭近心端， 进行血管插管后固定。手术结束后打开动脉夹，将血液放入含有3. 8%柠檬酸钠的试管中， 使血液与3. 8%柠檬酸钠容积之比为9 1。将上述制备的抗凝血液混勻后按不同的离心 速度制备富血小板血浆(RPR)和贫血小板血浆(PPP)。800rpm离心IOmin后吸取上层血浆 即得PRP ；将剩余血液2500rpm离心IOmin后吸取上层血浆即得PPP。以PPP调PRP使血小 板数为360X 109/L。先取250 μ 1 PPP加入测试杯中，然后放入测试孔，按“PPP”键进行定 标。然后取250 μ 1 PRP加入测试杯中，在37°C预温槽中预热lmin，放入测试孔后加入15 μ 1 不同浓度的药液，设空白对照组，不同浓度加药组(终浓度为14，28 μ g/ml)，按“开始”键 时立即加入诱导剂15μ1 (诱导剂的浓度为0. 144mg/ml ADP)，以测定最大聚集率。每次测 定3个通道，以求得平均最大聚集率，分别为61. 32士 15. 66，52. 35士9. 05,40. 70士5. 17，用 Prism软件对数据进行t检验，按公式计算抑制率(％)=(空白对照组最大聚集率-给药 组最大聚集率)/空白对照组最大聚集率X 100%，分别为14. 63，33. 63%。
权利要求
一种黑三棱内酯B化合物，其特征在于该化合物的化学结构式如下F2009100336863C00011.tif
2. 一种制备权利要求1所述的黑三棱内酯B化合物的方法，其特征在于制备步骤如下(1)提取取黑三棱的干燥块茎，粉碎，用乙醇水溶液浸泡2天，再用乙醇水溶液加热回 流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩至无醇味；(2)分离将上述浓缩液加1倍水稀释成混悬液，再分别以石油醚，乙酸乙酯，正丁醇 萃取，乙酸乙酯萃取液合并浓缩得浸膏后，用硅胶柱层析纯化，以石油醚乙酸乙酯梯度洗 脱，薄层层析检查，收集含黑三棱内酯B的流分，合并浓缩后再经硅胶柱层析，以石油醚-乙 酸乙酯梯度洗脱，薄层层析检查，得到黑三棱内酯B纯品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤(1)中所述的乙醇水溶液为 70% 95%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤(2)中用硅胶柱层析，先以石油 醚乙酸乙酯=100 70 O 30梯度洗脱，然后以石油醚-乙酸乙酯=98 80 2 20的梯度洗脱。
5.如权利要求1所述的黑三棱内酯B化合物在制备治疗和预防动脉粥样硬化疾病药物 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新氧杂蒽类化合物黑三棱内酯B(sparstolenin B)，其化学结构式如下它是从黑三棱科黑三棱属植物黑三棱(Sparganium stoleniferum Buch-Ham)的干燥块茎中提取分离得到。黑三棱内酯B具有抑制动脉平滑肌细胞迁移，抑制巨噬细胞介导的低密度脂蛋白氧化和抗血小板聚集活性，可作为治疗和预防动脉粥样硬化疾病的药物。
文档编号C07D493/06GK101899054SQ20091003368
公开日2010年12月1日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者吴启南, 梁侨丽, 樊大平, 段金廒, 高羽 申请人:南京中医药大学