脑信号蛋白-4d结合分子治疗动脉粥样硬化的用图
【专利摘要】本发明提供了用于在患有动脉粥样硬化的对象中减少、抑制、阻止和/或延迟动脉粥样硬化斑块生长或新血管形成的方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白?4D(SEMA4D)或其高亲和性丛蛋白?B1受体的分离的结合分子。
【专利说明】脑信号蛋白-4D结合分子治疗动脉粥样硬化的用途
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[0002] 用本申请提交的电子提交ASCII文本文件序列表（名称："Sequence_Listing_ 58008_136615. txt" ；大小:36，964字节;和创建日期：2014年10月9日）的内容通过引用全文 纳入本文。
[0003] 发明背景
[0004]脑信号蛋白4D(SEMA4D)，也称作⑶100,是一种属于IV型脑信号蛋白基因家族的跨 膜蛋白（例如，SEQ ID N0:1(人）；SEQ ID N0:2(鼠））<^ΕΜΑ4?在细胞表面上表达为同二聚 体，但在细胞激活之后，SEMA4D可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放以生成该蛋白质的 溶解形式sSEMA4D，这也是有生物活性的。参见Suzuki等，Nature Rev. Immunol · 3:159-167 (2003);Kikutani等，Nature Immunol.9:17-23(2008)。
[0005] SEMA4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴 器官中以高水平表达。在淋巴器官中，SEMA4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞 和抗原呈递细胞(APC)如树突细胞(DC)上弱表达。然而，在用各种免疫刺激激活之后，其表 达在这些细胞中上调。细胞激活也增加了可溶性SEMA4D从免疫细胞的释放。
[0006] 动脉粥样硬化已经被认为是一种炎性疾病，其中免疫细胞在疾病发展期间起到关 键作用（Hansson GK等，Nat Rev Immunol 6:508-519，2006)。巨噬细胞表达CD40分子并且T 细胞在其细胞表面上具有CD40配体(CD40L或CD154)(Mach F等，Circulation 96:396-399， 1997;和Mach F等，Proc Natl Acad Sci USA 94:1931-36，1997) XD40与斑块内免疫细胞 上的CD40L的连接诱导蛋白酶和促炎性介体的分泌，其扩大炎性活化（Mach F等， Circulation 96:396-399，1997)。〇)40连接的阻断或CD40L基因敲除可在有动脉粥样硬化 倾向的小鼠中减少动脉粥样硬化斑块发展（Mach F等，Nature 394: 200-203,1998;和 Lutgens E等，Nat Med 11:1313-1316，1999)。已经报道免疫细胞上的CD40与刺激抗-CD40 抗体的连接诱导Sema4D(Q)100)的表达(Kumanogoh A等，Immunity 13:621-31，2000) 〇
[0007] SEMA4D涉及各种过程，如增强免疫应答、血管生成、上皮形态发生和骨重塑 (Kruger RP等，Nat Rev Mol Cell Biol 6:789-800,2005;Pasterkamp R.J.，Nat Rev Neurosci 13:605-618,2012;和Kang S等，Seminars in Cell&Dev Biol 24:163-171， 2013)。动脉粥样硬化斑块中的淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞和血小板在其膜表面上表达 丛蛋白（Plexin)-Bl，一种Sema4D的高亲和性受体（Basile JR等，Moll Cell Biol 25: 6889_6898,2005;Delaire S等，J Immunol 166:4348-4354,2001;和Chabbert-de Ponnat I等，Int Immunol 17:439-447，2005)。因此，由T细胞表达或从T细胞膜释放的Sema4D可对 位于动脉粥样硬化斑块中的细胞具有某些作用（Basile JR等，Mol.Cell Biol 25:6889-6898,2005;Delaire S等，J Immunol 166:4348-4354，2001;和Chabbert-de Ponnat I等， Int Immunol 17:439-447，2005)。之前的研究揭示了Sema4D在体外和体内对内皮细胞的促 血管生成活性（Conrotto P等，Blood 105:4321_4329,2005;和Basil JR等，Cancer Res 64:5212-5224，2004)。此外，在几种鳞状细胞癌症中观察到高水平的Sema4D表达，表明 Sema4D在体内肿瘤诱导的血管生成中起关键作用(Basile JR等，Proc Natl Acad Sci USA 103:9017-9022,2006)。因此，Sema4D可通过例如促进粥样斑中发成的新血管形成过程来影 响斑块生长。事实上，一项研究揭示在有动脉粥样硬化倾向的ApoE缺陷型(ApoE-/-)小鼠中 删除Sema4D基因延迟斑块区域中动脉粥样硬化斑块的生长和新血管形成，表明在动脉粥样 硬化的发展期间阻断Sema4D信号可防止斑块生长和新血管形成（Yukawa K等，Int.J Mol.Med.26:39-44,2010)。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了使用脑信号蛋白4D结合分子治疗动脉粥样硬化的方法。按照本文所 示的本发明的方面，提供了在患有动脉粥样硬化的对象中减少、抑制、阻止和/或延迟动脉 粥样硬化斑块形成的方法，包括向对象给予有效量的分离的结合分子，所述结合分子特异 性结合并阻断脑信号蛋白4D(SEMA4D)的活性。在某些实施方式中，提供了用于在患有动脉 粥样硬化的对象中抑制、阻止、减少或延迟动脉粥样硬化斑块生长的方法，包括向该对象给 予有效量的分离的结合分子，所述结合分子特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)。在某些实 施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体的相互作用。在某些实施方式中，受体是丛蛋白-B1或丛蛋白-B2。在某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。在 任意前述方法的某些实施方式中，对象患有心血管疾病。在某些实施方式中，心血管疾病选 自下组:冠心病(也称为缺血性心脏病或冠状动脉疾病）、心肌病、高血压心脏病、心力衰竭、 肺源性心脏病、心脏节律障碍、炎性心脏病心内膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎、心脏瓣膜病、 脑血管病、外周动脉疾病、先天性心脏病、风湿性心脏病、及其组合。在任意前述方法的某些 实施方式中，分离的结合分子与参照单克隆抗体VX15/2503或67特异性结合相同的SEMA4D 表位。在任意前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑制参照单克隆抗体 VX15/2503或67与SEMA4D的特异性结合。在任意前述方法的某些实施方式中，分离的结合分 子包括抗体或其抗原结合片段。在任意前述方法的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片 段的可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VIXDR 1-3，VHCDR 1-3分别包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID N0:14、15和16。如任意前述方法的某些实施方 式中，VH和VL分别包含SEQIDN0:9和SEQIDN0 :17或SEQIDN0:10和SEQIDN0:18。在任 意前述方法的某些实施方式中，该方法还包括抑制、延迟、减少或延缓动脉粥样硬化斑块周 围的新血管形成。
[0009] 还提供了方法，用于在患有动脉粥样硬化的对象中抑制、延缓、减少或延迟新血管 形成的方法，包括向该对象给予有效量的分离的结合分子，所述结合分子特异性结合脑信 号蛋白_4D(SEMA4D)。在某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D与其受体的相互作用。在某 些实施方式中，受体是丛蛋白-B1。在某些实施方式中，结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋 白-B1信号转导。在任意前述方法的某些实施方式中，对象患有心血管疾病。在某些实施方 式中，心血管疾病选自下组:冠心病(也称为缺血性心脏病或冠状动脉疾病）、心肌病、高血 压心脏病、心力衰竭、肺源性心脏病、心脏节律障碍、炎性心脏病心内膜炎、炎性心脏肥大、 心肌炎、心脏瓣膜病、脑血管病、外周动脉疾病、先天性心脏病、风湿性心脏病、及其组合。在 任意前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子与参照单克隆抗体VX15/2503或67特异 性结合相同的SEMA4D表位。在任意前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑 制参照单克隆抗体VX15/2503或67与SEMA4D的特异性结合。在任意前述方法的某些实施方 式中，分离的结合分子包括抗体或其抗原结合片段。在任意前述方法的某些实施方式中，抗 体或其抗原结合片段的可变重链(VH)含有VH⑶R 1-3且可变轻链（VL)含有VIXDR 1-3， VHCDR 1-3分别包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID N0:14、15和 16。在任意 前述方法的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQIDN0:9和SEQIDN0:17或SEQIDN0 : 10和SEQ ID NO:18。
[0010] 还提供了治疗患有动脉粥样硬化的对象的方法，所述方法包括：向确定有动脉粥 样硬化斑块的对象给予有效量的分离的结合分子，所述结合分子特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)，从而抑制、延缓、减少或延迟动脉粥样硬化斑块的生长。在某些实施方式中，通 过分析来自患者的图像或样品来提供确定。在任意前述方法的某些实施方式中，如果患者 中的动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征超过预定阈值数量、尺寸或特征则确定患者有 动脉粥样硬化斑块并且接受治疗。在任意前述方法的某些实施方式中，如果当与一个或多 个对照样品比较时，患者中的动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征指示动脉粥样硬化则 确定患者有动脉粥样硬化斑块并且接受治疗。在任意前述方法的某些实施方式中，如果样 品中CRP和/或LDL的水平超过预定阈值水平，相对于对照样品升高，或者指示动脉粥样硬化 斑块则确定患者有动脉粥样硬化并且接受治疗。在任意前述方法的某些实施方式中，如果 成像确定动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征超过预定阈值水平，相对于对照样品升高， 或者指示动脉粥样硬化斑块，则确定患者有动脉粥样硬化并且接受治疗。在该方法的某些 实施方式中，成像可包括冠状血管造影、血管内超声（IVUS)、颈动脉超声、冠状动脉计算机 断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)光学相干断层成像(0CT)、 近红外光谱(NIRS)、和NIR荧光。在任意前述方法的某些实施方式中，如果患者确定具有一 个或多个易感的动脉粥样硬化斑块，则确定患者有动脉粥样硬化斑块并接受治疗。在任意 前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子与参照单克隆抗体VX15/2503或67特异性结 合相同的SEMA4D表位。在任意前述方法的某些实施方式中，分离的结合分子竞争性抑制参 照单克隆抗体VX15/2503或67与SEMA4D的特异性结合。在任意前述方法的某些实施方式中， 分离的结合分子包括抗体或其抗原结合片段。在任意前述方法的某些实施方式中，抗体或 其抗原结合片段的可变重链(VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VIXDR 1-3，VH⑶R 1-3分别包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分别包含SEQ ID N0:14、15和16。在任意前述方法 的某些实施方式中，VH和VL分别包含SEQIDN0:9和SEQIDN0 :17或SEQIDN0:10和SEQ ID N0：18〇
[0011] 根据本文所示的方面，提供了一种减少患有动脉粥样硬化的对象中新血管形成的 方法，包括向该对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白4D(SEMA4D)的分离的结合分子。
[0012] 附图简述
[0013]图1A:在用抗-Sema4D抗体治疗的ApoE-缺陷型自发性高脂血症（SHL)小鼠中受到 抑制的动脉粥样硬化斑块发展。图1A显示对在从14周龄开始持续12周用抗-SEMA4D抗体或 同种型对照治疗的SHL小鼠中动脉粥样硬化斑块的脂质沉积物中嗜苏丹面积的定量测量。 [0014]图1B和1C:抗-Sema4D抗体治疗的SHL小鼠中斑块的减少的新血管形成。图1B显示 通过对抗-Sema4D抗体治疗的SHL小鼠和对照抗体治疗的SHL小鼠中的内皮细胞的凝集素 B4 染色定量测量可视化的新血管形成。图1C显示使用CD31抗体免疫组化可视化的抗-Sema4D 抗体治疗的SHL小鼠和对照抗体治疗的SHL小鼠的斑块中的内皮细胞。
[0015] 发明详述
[0016] I.定义
[0017]需要注意，术语"一个"或"一种"实体指一种或多种该实体;例如，"一种抗-SEMA4D 抗体"应理解为代表一种或多种抗-SEMA4D抗体。如此，术语"一个"（或"一种""一个或多 个"和"至少一个"在本文中可互换使用。
[0018] 本文所用术语"动脉粥样硬化"是指大多数冠状动脉疾病、主动脉瘤和下肢动脉疾 病之下的较大动脉的疾病，并且也在脑血管疾病中起主要作用。在美国对于65岁以上和以 下的男女，动脉粥样硬化是主要死亡原因，E.L.Bierman，〃动脉粥样硬化和动脉粥样硬化的 其它形式（Atherosclerosis and Other Forms of Arteriosclerosis)〃第208章，第1106 页，Harrisor/s Principles of Internal Medicine(《哈里森内科学原理》），第13版， KJ. Isselbacher等编(麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill，Inc ·)，纽约，1994)。动脉粥样硬化 可影响体内的任何动脉，包括心脏、脑、手臂、腿、骨盆和肾脏中的动脉。动脉粥样硬化的特 征在于胆固醇渗透并且在动脉壁的伤口处出现泡沫细胞。这之后是复杂的系列变化，涉及 血小板、巨噬细胞、平滑肌细胞和产生增殖性伤口的生长因子。这些扭曲了血管并使其变得 刚性。在血浆胆固醇水平升高的个体中，动脉粥样硬化及其并发症的发病率增加。 W.F.Ganong，《医学生理学》（Review of Medical Physiology)，第17版，第281 页 (Appleton&Lange Norwalk,CT 1995)〇
[0019] 本文所用术语"新血管形成"或"血管发生"是指从现有血管形成新血管。例如，在 黄斑变性、肿瘤、癌症和动脉粥样硬化的发展中存在新血管形成。
[0020] 本文所用术语"炎性疾病"或"炎性病症"是指特征为炎症并且通常伴随发红、肿胀 和疼痛的疾病。炎症可导致宿主其它疾病，包括但不限于，心血管疾病、类风湿性关节炎、胃 肠道疾病、神经炎性疾病(例如，多发性硬化)甚至癌症(例如，胆囊癌）。
[0021] 本文所用术语"心血管疾病"是指涉及心脏、血管（动脉、毛细血管和静脉)或同时 涉及两者的疾病。心血管疾病的示例包括但不限于，冠心病(也称为缺血性心脏病或冠状动 脉疾病）、心肌病、高血压心脏病、心力衰竭、肺源性心脏病、心脏节律障碍、炎性心脏病心内 膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎、心脏瓣膜病、脑血管病、外周动脉疾病、先天性心脏病、和风湿 性心脏病。
[0022]术语"治疗有效量"是指对"治疗"对象或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗 体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物的量。在动脉粥样硬化的情况中，治疗有效量的 药物可延迟动脉粥样硬化斑块的形成;减少、阻滞或停止新动脉粥样硬化斑块形成的增加； 在动脉粥样硬化斑块中或在动脉粥样硬化斑块周围减少、阻止或停止炎症;抑制，例如，阻 止、阻滞、防止、停止或逆转新血管形成;动脉粥样硬化斑块的形态或功能变化;或在一定程 度上缓解与动脉粥样硬化相关的一种或多种症状;降低发病率和死亡率;改善生活质量;或 这些效果的任意组合。
[0023]术语，如"治疗"或"缓解"同时指1)治愈、减缓、减少诊断的病理病症或疾病的症 状、逆转和/或终止诊断的病理病症或疾病的进展和2)预防和/或减缓靶向的病理病症或疾 病的发展的预防性措施。因此，需要治疗的那些人包括已经患有疾病的那些人;易于患有疾 病的那些人；和需要预防疾病的那些人。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不 可检测的缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定（即不恶化）、延迟或减缓疾病进展、改善 或减轻疾病状态、缓解(部分或完全）、或其任意组合。"治疗"也可以指与不接受治疗的期望 存活相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或疾病的人，以及倾向于患有病症 或疾病的人或需预防病症或疾病的人。
[0024] "对象"或"个体"或"动物"或"患者"或"哺乳动物"指需要诊断、预防或治疗的任何 对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物 或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。
[0025] 本文所用的术语"给予抗-SEMA4D抗体时能够获益的对象"和"需要治疗的动物"包 括能够从给予抗-SEMA4D抗体或其它SEMA4D结合分子和/或从用抗-SEMA4D抗体或其它 SEMA4D结合分子治疗（即减轻或预防疾病）中获益的对象(如哺乳动物对象），该抗体或结合 分子可用于(例如)检测抗-SEMA4D多肽(如用于诊断方法）。
[0026] 广义来说，本发明的〃结合分子〃或〃抗原结合分子〃指特异性结合抗原决定簇的分 子。在一个实施方式中，结合分子特异性结合SEMA4D，例如，约150kDa的跨膜SEMA4D多肽或 约120kDa的可溶性SEMA4D多肽(通常称为SSEMA4D)。在另一个实施方式中，本发明的结合分 子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括抗体分子的至 少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体 分子的至少2个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分 子的至少3个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子 的至少4个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的 至少5个CDR。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至 少6个CDR。
[0027] 本发明涉及治疗动脉粥样硬化的方法，包括向对象给予抗-SEMA4D结合分子，例如 抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特别提到完整大小的抗体如天然产生的抗 体，术语"抗-SEMA4D抗体"包括完整大小的抗体以及这种抗体的抗原结合片段、变体、类似 物或衍生物，例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子，或以类似于抗体分子的方式结合抗 原的经工程改造抗体分子或片段。
[0028] 本文所用的"人"或"全人"抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体并包括 分离自人免疫球蛋白文库或一种或多种人免疫球蛋白转基因动物的抗体，如上文所述，例 如，Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。"人"或"全人"抗体也包括至少含重链可变区 或至少重链和轻链可变区的抗体，其中所述可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列 或是人源化抗体。
[0029] "人"或"全人"抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子(如VH区和/或VL区）的 变体(包括衍生物)或基本由其组成或由其组成的"人"或"全人"抗体，所述抗体或其片段免 疫学特异性结合于SEMA4D多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的标准技术在 编码人抗-SEMA4D抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，引起氨基酸取代的定点诱 变和PCR介导的诱变。在一些方面中，相对于参照VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLg、 VLCDR1、VIXDR2或VIXDR3，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸 取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸 取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代 或少于2个氨基酸取代。
[0030] 在某些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所详述。或者，也可沿 所有或一部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，可筛选所得突变体的生物 学活性以鉴定保持活性(例如，结合SEMA4D多肽，如结合人SEMA4D、鼠 SEMA4D或同时结合人 和鼠 SEMA4D的能力）的突变体。"人"或"全人"抗体的这类变体（或其衍生物）也可称为"优 化"或"就抗原结合优化"的人或全人抗体，包括对抗原亲和性提高的抗体。
[0031] 术语"抗体"和"免疫球蛋白"在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括重 链可变区，通常至少包括重链和轻链的可变区。较好地理解了脊椎动物系统中的基本免疫 球蛋白结构。参见例如，Harlow等（1988)《抗体：实验室手册》(Antibodies : A Laboratory Manual)(第2版;冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
[0032] 本文所用术语"免疫球蛋白"包括可在生物化学上区分的各种类型多肽。本领域技 术人员应理解，重链分为伽马、缪、阿尔法、德尔塔或伊普西龙（γ，μ，α，δ， ε)，其中还有一些 亚类(如γ1-γ4)。该链的特性决定抗体"类别"分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白 亚类（同种型）如IgGl、]^62、]^63、]^64、]^41等已被良好表征，且已知赋予功能特化。根据 本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类别和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在 本发明范围内。所有免疫球蛋白类别明显属于本发明范围，以下讨论通常针对免疫球蛋白 分子的IgG类。在IgG中，标准的免疫球蛋白分子包括分子量约为23,000道尔顿的两条相同 轻链多肽和分子量为53,000-70，000的两条相同重链多肽。这四条链通常在?'构型中由二 硫键连接起来，其中轻链从Y的口部开始托起重链，并延续通过可变区。
[0033] 轻链分类为κ或λ。各重链类可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合， 并且当由杂交瘤、Β细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的"尾"部 分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Υ构型的分叉末端处的Ν-端到各条链的底部处的C-端。
[0034] 轻链和重链都划分成结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语"恒定"和 "可变"。在这方面，应理解轻链(VL或VK)和重链(VH)部分的可变区决定抗原识别和特异性。 相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区产生重要的生物学特性，例如分泌、跨胎盘 移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或 抗体的氨基端而增加。N-端区是可变区并且C-端区是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包 括重链和轻链的羧基端。
[0035] 如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗 体的VL和VH结构域、或这些可变区内的互补决定区（CDR)亚组组合形成确定三维抗原结合 位点的可变区。这种四联抗体结构形成在Y的每条臂末端存在的抗原结合位点。更具体地， 所述抗原结合位点由各VH和VL链上的三个CDR确定。在一些情况下，例如在衍生自羊驼种类 或根据羊驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可仅由 重链构成而不含轻链。参见例如，Hamers-Casterman等，Nature 363:446-448( 1993)。
[0036]在天然产生的抗体中，每个抗原结合结构域上出现的六个"互补决定区"或"CDR" 是短的非毗连氨基酸序列，随着抗体在水性环境中确定其三维构型时，它们特别定位以形 成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为"构架"区，显示较小的分子间差 异。构架区主要采用β-片层构象，CDR形成连接β-片层结构和某些情况下形成部分β-片层结 构的环。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。 定位的CDR形成的抗原结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互 补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领 域普通技术人员能容易地鉴定分别包含CDR和构架区的氨基酸，因为它们已被精确定义(见 下文）。
[0037] 除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两 种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语 "互补决定区"（"CDR"）描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这 一特定区域的描述可参见Kabat等（1983)美国健康和公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫 学重要性的蛋白质序列)"以及Chothia和Lesk，J.Mol .Biol. 196:901-917(1987)(上述文献 通过引用全文纳入本文），互相比较时所述定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基亚组。 尽管如此，应用任一定义指抗体或其变体的CDR均应落入本文所定义和使用的术语范围。合 适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，所述氨基酸残基列于下表1以作比 较。包括特定CDR的准确残基编号根据CDR的序列和大小而变化。在抗体的可变区氨基酸序 列给定的情况下，本领域技术人员可常规确定哪些残基包含具体CDR。
[0038] 表1.CDR 定义1
[0040] 1表1中所有⑶R定义的编号均按照Kabat等所述的编号规则(见下文）。
[0041] Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人 员能明确地将所述"Kabat编号"系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何 实验数据。本文所用的"Kabat编号"指Kabat等（1983)美国卫生与公众服务部，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学上感兴趣的蛋白质序列)"中所述的编 号系统。除非另有说明，提到本发明的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中 具体氨基酸残基位置的编号时，均按照Kabat编号系统。
[0042] 本发明的抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物包括但不限于:多克隆、单克隆、 多特异性和双特异性(其中至少一个臂对SEMA4D有特异性）、人、人源化、灵长类化或嵌合抗 体，单链抗体，表位结合片段如Fab、Fat/和F(at/ )2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv (sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括 例如，本文所述抗-SEMA4D抗体的抗-Id抗体）dcFv分子为本领域已知，描述于例如美国专 利号5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型（如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA和IgY)、类(如1861、1862、1863、1864、1841和以42等)或小类的免疫球蛋白分子。
[0043] 本文所用的术语"重链部分"包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。在某些实 施方式中，多肽包含包括以下至少一种的重链部分:VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上、 中、和/或下铰链区）结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，本发明所用的结 合多肽可包括含有CH1结构域的多肽链;含有CH1结构域、至少一部分绞链区和CH2结构域的 多肽链;含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链;含有CH1结构域、至少一部分绞链区和CH3结 构域的多肽链，或者含有CH1结构域、至少一部分绞链区、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。 在另一实施方式中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。另外，本发明所用的结合 多肽可能缺少CH2结构域的至少一部分(例如，所有或部分CH2结构域）。如上所述，本领域普 通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链部分），从而其氨基酸序列不同于天然产 生的免疫球蛋白分子。
[0044] 在本文公开的某些抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体 的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链相同。或者，本发明的含有重链部分 的单体是不同的。例如，各单体可包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。
[0045] 用于本文所述方法的结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例 如，多肽的重链部分可包含衍生自IgGl分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另 一个示例中，重链部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG3分子的绞链区。在另一 个示例中，重链部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
[0046] 本文所用的术语"轻链部分"包括衍生自免疫球蛋白轻链，如κ或λ轻链的氨基酸序 列。在一个方面中，轻链部分包含VL或CL结构域中的至少一种。
[0047] 本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据它们识别或 特异性结合的抗原如本文所述靶标多肽(如SEMA4D)的表位或部分进行描述或说明。靶多肽 与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是"表位"或"抗原决定簇"。靶多肽可包含 单个表位，但通常包含至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构 象和类型。而且，应该注意到，靶标多肽上的"表位"可以是或可包括非多肽元件，例如表位 可包括糖侧链。
[0048] 认为抗体的肽或多肽表位的最小尺寸是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位可含有至 少7个，至少9个，或至少约15至约30个氨基酸。由于⑶R能以三联形式识别抗原性肽或多肽， 所以包含表位的氨基酸不必定是毗连的，可在2条或更多条不同肽链上。本发明的抗-SEMA4D抗体识别的肽或多肽表位可含有SEMA4D中至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至 少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约15-约30个毗连或非毗连的 氨基酸。
[0049] "特异性结合"通常指该抗体通过其抗原结合结构域结合于表位，并且该结合需要 抗原结合结构域和表位之间某种程度的互补。按照这一定义，当抗体通过其抗原结合结构 域与表位结合比与随机无关的表位结合更容易时，称该抗体"特异性结合"该表位。本文中 使用术语"特异性"定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，抗体"Α"可被认 为比抗体"Β"对给定表位具有更高特异性，或者抗体"Α"据说可以比对相关表位"D"的特异 性更高的特异性或亲和性结合表位Τ'。
[0050] "优选结合"指与结合相关、相似、同源或类似的表位相比，该抗体更容易特异性结 合某表位。因此，与相关表位相比，"优选结合"给定表位的抗体更可能结合该表位，即便这 种抗体可能与相关表位发生交叉反应。
[0051]作为非限制性示例，如果抗体与第一表位结合的解离常数(KD)低于抗体与第二表 位的KD，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位 结合的亲和性比抗体与第二表位的K D低至少一个数量级，则可认为抗体优选结合第一抗 原。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的Kd 低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。
[0052]在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))比抗体 与第二表位的k(〇ff)低，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果 抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的k(off)低至少1个数量级，则可认为抗 体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗 体与第二表位的k(off)低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。可以说，本文 所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(例如，SEMA4D，例如， 人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于或等于5X 10^^、10 ΑΛ5Χ ΠΓΥ1或ΙΟΛ'在某些方面中，可以说，本发明的抗体结合本文公开的靶多肽(例 如，SEMA4D，例如，人、鼠、或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或变体，其解离速率(k(of f))低于或 等于 5X 10-4s-\10-4s-\5X 10-5s-\或 10-5s-\5X 10-6s-\10-6s-\5X 10-7s-1 或 10-7s-、
[0053] 可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多 肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大 于或等于1〇3Μ?，5Χ lOtVSlOtV1或5X lOtV1。在某些方面中，可以说本发明的抗 体结合本文公开的靶多肽(如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的SEMA4D)或其片段或变体，其结 合速率(k(on))大于或等于 105M-\5X 105M-^106]^1 或 5X 106M-1 或 107M-、
[0054] 如果抗体优先结合给定表位以至于在某种程度上阻断参照抗体与该表位的结合， 则称该抗体能竞争性抑制参照抗体与该表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞 争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说，抗体将参照抗体与给定表位的结合竞争性抑制至 少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
[0055] 本文所用的术语"亲和性"指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR结合的强度量度。 参见例如，Harlow等（1988)《抗体:实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉 港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版），第27-28页。本文所用 的术语"亲合力"指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与 抗原的功能性结合强度。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独免疫球蛋 白分子与特定表位的亲和性相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克 隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一 个例子。
[0056] 本发明的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物也可就其交叉反应 性方面进行描述或说明。本文所用的术语"交叉反应性"指抗体对某一种抗原具有特异性、 与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果抗 体与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含 有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。
[0057] 例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位， 例如，与参照表位至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少 65%、至少60%、至少55%和至少50%相同（按照本领域已知方法和本文所述方法计算）的 表位。如果抗体不结合与参照表位少于95%、少于90%、少于85%、少于80%、少于75%、少 于70%、少于65%、少于60%、少于55%和少于50%相同性(按照本领域已知方法和本文所 述方法计算)的表位，则可以说该抗体的交叉反应性很低或没有交叉反应性。如果某抗体不 结合某表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物，则可认为该抗体对该表位"高度特 异"。
[0058]本发明的抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据与 本发明多肽的结合亲和性进行描述或说明，所述多肽例如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的 SEMA4D。结合亲和性可包括解离常数或 Kd 低于 5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10 、、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10 -10M、10-10M、5x 10-nM、10-nM、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10- 15M或1(T15M的那些。在某些实施方式中，抗-SEMA4D结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原 结合片段以约5χ 10_9至约6χ 10_9的Kd结合人SEMA4D。在另一个实施方式中，抗-SEMA4D结 合分子，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段以约lx ΗΓ9至约2χ 10-9的Kd结合鼠 SEMA4D。
[0059] 本文所用的术语"嵌合抗体"指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物 种，而恒定区（根据本发明，可能是完整、一部分或修饰的）获自第二物种的任何抗体。在一 些实施方式中，靶标结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人 的。
[0060] 本文所用的术语"工程改造的抗体"指通过从具有已知特异性的抗体至少部分置 换一个或多个CDR和必要时通过部分构架区置换和序列变化，来改变重链或轻链或二者中 可变区的抗体。虽然CDR可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但设 想CDR衍生自不同类别的抗体，例如，不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体 的一个或多个"供体" CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称 为"人源化抗体"。在某些实施方式中，可能不必定用来自供体可变区的完整CDR代替所有 CDR以将一种可变区的抗原结合能力转移至另一可变区。相反，可仅仅转移维持靶结合位点 的活性所需的那些残基。
[0061 ]进一步认识到，人源化抗体的重链或轻链或二者中可变结构域内的构架区可仅包 含人来源的残基，在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为"全人构架区"（例如，MAb VX15/2503,在美国专利申请公开号US 2010/0285036 A1中为MAb 2503,其全文通过引用纳 入本文）。或者，如果需要维持与SEMA4D抗原的适当结合或提高结合，可以在人源化抗体的 重链或轻链或二者可变区中人框架区的相应位置内工程改造供体可变区中框架区的一个 或多个残基。因此，以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合物，在本 文中称为"部分人构架区"。
[0062] 例如，抗-SEMA4D抗体的人源化过程可基本按照Win ter和同事所述方法进行 (Jones等，Nature 321:522-525(1986);Riechmann等，Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988))，即用啮齿动物或突变型啮齿动物CDR或CDR 序列取代人抗-SEMA4D抗体的相应序列。也参见美国专利号5，225，539; 5，585，089; 5，693， 761; 5，693，762; 5，859，205;其通过引用纳入本文。所得的人源化抗-SEMA4D抗体将在人源 化抗体的重链和/或轻链可变区的全人框架区内包含至少一个啮齿动物或突变型啮齿动物 CDR。在一些情况下，人源化抗-SEMA4D抗体的一个或多个可变区的构架区内残基被相应非 人(例如，啮齿动物)残基代替（参见例如，美国专利号5,585,089;5,693,761;5,693,762;和 6,180,370)，在这种情况下所得的人源化抗-SEMA4D抗体将在重链和/或轻链的可变区内包 含部分人框架区。
[0063]而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰 以进一步改善抗体性能(例如，获得所需亲和性）。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少 一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，全部或 基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体还任选包含至少一部分免 疫球蛋白恒定区（Fc )，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的细节参见Jones等，Nature，331: 522-525(1986) ;Riechmann等，Nature，332:323-329(1988);和Presta， Curr · Op · Struct · Biol ·，2:593-596(1992);其通过引用全文纳入本文。因此，所述"人源化" 抗体可包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。在实 践中，人源化抗体一般是一些CDR残基，可能是一些框架残基被啮齿动物抗体中相似位点的 残基所取代的人抗体。参见，例如，美国专利号5，225，539; 5，585，089; 5，693，761; 5，693， 762;5,859,205。也参见美国专利号6，180,370和国际公开号冊01/27160，其中公开了人源 化抗体和用于产生对预定抗原的亲和性提高的人源化抗体的技术。
[0064] II.靶标多肽描述
[0065]本文所用术语"脑信号蛋白_4D"、"SEMA4D"和"SEMA4D多肽"可互换使用，如 "SEMA4D"和"Sema4D"。在某些实施方式中，SEMA4D表达在细胞表面上或由细胞分泌。在另一 个实施方式中，SEMA4D是膜结合的。在另一个实施方式中，SEMA4D是可溶的，例如SSEMA4D。 在其他实施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D变体多肽，其中 SEMA4D或SEMA4D变体多肽的片段保留完整大小的SEMA4D的一些或全部功能性质。
[0066]完整大小的人SEMA4D蛋白质是由2条150kDa的多肽链组成的同二聚体跨膜蛋白。 SEMA4D属于脑信号蛋白家族细胞表面受体并且也称为CD100。人和小鼠 SEMA4D/Sema4D从其 跨膜形式经蛋白水解切割以形成120-kDa可溶性形式，表明存在2种Sema4D同种型 (Kumanogoh等，J.Cell Science 116(7): 3464(2003))。脑信号蛋白由可溶性和膜结合蛋白 组成，其原始定义为发育期间的轴突引导因子，其在建立神经元与其合适靶标的精确连接 中起到重要作用。从结构上考虑，IV类脑信号蛋白，SEMA4D由氨基末端信号序列接着特征性 "Sema"结构域组成，其含有17个保守的半胱氨酸残基、Ig-样结构域、富赖氨酸伸长段、疏水 性跨膜结构域和胞质尾。
[0067] SEMA4D的各多肽包含约13个氨基酸的信号序列，之后是约512个氨基酸的脑信号 蛋白结构域，约65个氨基酸的免疫球蛋白样（Ig-样)结构域，104个氨基酸的富赖氨酸伸长 段，约19个氨基酸的疏水性跨膜区，和110个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共 有位点支持SEMA4D与酪氨酸激酶的预测结合(Schlossman等编，（1995)Leucocyte Typing V(《白细胞分型V》）（牛津，牛津大学出版社(Oxford University Press，0xford)))。
[0068] SEMA4D已知具有至少3个功能性受体，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和⑶72。受体之一，丛 蛋白-B1在非淋巴组织中表达并且已经显示为SEMA4D的高亲和性（InM)受体(Tamagnone等， Cell 99:71-80(1999))。丛蛋白-B1信号转导的SEMA4D刺激已经显示出诱导神经元的生长 锥塌陷，并且诱导少突细胞的过程延伸塌陷（process extension collapse)和凋亡 (Giraudon等，J.Immunol·172:1246-1255(2004);Giraudon等，NeuroMolecular Med·7: 207-216(2005))。在与SEMA4D结合之后，丛蛋白-B1信号转导介导R-Ras的失活，导致整联蛋 白介导的胞外基质粘附减少，以及RhoA的激活，导致通过重组细胞骨架和细胞迀移。参见 Kruger等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005);Pasterkamp，TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005)。在另一方面，丛蛋白-B2对SEMA4D有中等亲和性，并且最近的报 道表明丛蛋白-B2在角质形成细胞上表达并且激活SEMA4D-阳性γ δΤ细胞以促进上皮修复 (Witherden等，Immunity · 2012年8月24 日；37(2): 314-25)。
[0069] 在淋巴组织中，CD72用作低亲和性（300nM)SEMA4D受体（Kumanogoh等，Immunity 13:621-631 (2000)) 3细胞和APC表达CD72，并且抗-CD72抗体具有许多与sSEMA4D相同的作 用，如增强CD40-诱导的B细胞应答和CD23的B细胞脱落。CD72被认为通过招募酪蛋白磷酸酶 SHP-1发挥B细胞应答的负调节物的作用，其可与许多抑制性受体联合。SEMA4D与CD72的相 互作用导致SHP-1的解离，以及这种负激活信号的失去。SEMA4D已经显示促进T细胞刺激和B 细胞聚集以及体外存活。加入SEMA4D-表达细胞或SSEMA4D在体外增强⑶40-诱导的B细胞增 殖和免疫球蛋白产生，并且在体内加快抗体应答(Ishida等，Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003);Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol · 22:670-676(2001)) QSSEMA4D增强 ⑶40诱导的DC成熟，包括共刺激分子上调和增加的IL-12分泌。另外，sSEMA4D可抑制免疫细 胞迀移，其可能加入阻断抗-SEMA4D抗体来逆转（Elhabazi等，J. Immunol · 166:4341-4347 (2001);Delaire等，J·Immunol·166:4348-4354(2001))〇
[0070] Sema4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴 器官中以高水平表达。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞 和抗原呈递细胞(APC)如树突细胞(DC)上弱表达。细胞激活增加了SEMA4D的表面表达以及 可溶性SEMA4D (SSEMA4D)的生成。
[0071] SEMA4D的表达特性表明其在免疫系统中起到重要的生理和病理作用。SEMA4D已经 显示促进B细胞激活、聚集和存活;增强CD40-诱导的增殖和抗体产生;增强对T细胞以来抗 原的抗体响应;增加 T细胞增殖;增强树突细胞成熟和刺激T细胞的能力;和直接涉及脱髓鞘 和轴突变性（Shi等，Immunity 13 :633-642(2000) ;Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002);和Watanabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001))。
[0072] SEMA4D敲除（SEMA4D-/-)小鼠已经提供其他证据显示SEMA4D在体液和细胞免疫应 答中起到重要作用。在SEMA4D-/-小鼠中没有已知的非淋巴组织主要异常。来自SEMA4D-/-小鼠的树突细胞(DC)具有弱刺激能力并且在共刺激分子的表达中显示出缺陷，其可通过加 入SSEMA4D来拯救。SEMA4D缺陷（SEMA4D-/-)的小鼠无法发生由髓鞘少突细胞糖蛋白肽诱导 的实验性自身免疫脊髓炎，因为在缺少SEMA4D的情况下，髓鞘少突细胞糖蛋白特异性T细胞 生成微弱(Kumanogoh等，J Immuno 1 169:1175-1181( 2002))。也在自身免疫倾向型MRL/lpr 小鼠（全身性自身免疫疾病如SLE的模型)而不是正常小鼠的血清中检测到显著量的可溶性 SEMA4D。此外，SSEMA4D的水平与自身抗体的水平相关并且随着年龄增加(Wang等，Blood 97:3498-3504(2001))。可溶性SEMA4D也已经显示在患有脱髓鞘性疾病的患者的脑脊液和 血清中累积，并且SSEMA4D诱导人多潜能神经前体(Dev细胞）的凋亡，并且在体外抑制过程 扩展并诱导大鼠少突细胞的凋亡(Giraudon等，J Immunol 172(2): 1246-1255(2004))。由 抗-SEMA4D MAb封闭这种凋亡。
[0073] III ·抗-SEMA4D抗体
[0074] 已经在本领域中描述了结合SEMA4D的抗体。参见，例如，美国公开号2008/ 0219971A1、US 2010/0285036A1 和US 2006/0233793A1、国际专利申请WO 93/14125、W0 2008/100995和W0 2010/129917,以及Herold等，Int. Immunol .7(1): 1-8(1995)，其各自通 过引用全文纳入本文。
[0075]本发明一般涉及在患有炎性病症的对象，例如人患者中治疗动脉粥样硬化的方 法，包括给予特异性结合SEMA4D的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方 式中，该抗体阻断SEMA4D与其受体中的一种或多种，例如丛蛋白-B1的相互作用。具有这些 性质的抗-SEMA4D抗体可用于本文提供的方法。可使用的抗体包括，但不限于MAbs VX15/ 2503,67和76及其抗原结合片段、变体或衍生物，其全部描述于1^ 2010/028503641。可用于 本文提供的方法的其他抗体包括US 2006/0233793A1中所述的BD16和BB18抗体及其抗原结 合片段、变体或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、MAb 2280、 MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意种，及其任意片段、变体或衍 生物，如US 2008/0219971A1所述。在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗 体结合人、鼠或人和鼠 SEMA4D。还可使用与任意前述抗体结合相同表位的抗体和/或竞争性 抑制任意前述抗体的抗体。
[0076]在某些实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物具有与参照抗-SEMA4D抗体分子的氨基酸序列具有至少约80 %、约85 %、约 88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%或约95%序列相同性的氨基酸序列， 例如，上述的那些。在另一个实施方式中，所述结合分子与参照抗体共有至少约96%、约 97%、约98%、约99%或100%的序列相同性。
[0077]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区（VH结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID N0:9或10的CDRUCDR2或CDR3至少约 80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0078]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区（VH结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8至少约 80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0079]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白重链可变区（VH结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中除了 1、2、3、4或5个保守氨基酸取代以外，所述VH结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8完全相同的氨基酸序列。
[0080]在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片 段、变体或衍生物的包含VH结构域、基本由其组成或由其组成，该VH结构域具有与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少约80%、约85%、约90%、约91 %、约92%、约93%、约94%、约 95 %、约96 %、约97 %、约98%、约99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗体包含 特异性或优先结合SEMA4D的编码VH结构域。
[0081]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区（VL结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQ ID如：17或18的〇?1工01?2或〇)1?3至少约 80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0082]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区（VL结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中所述VL结构域的至少一个CDR具有与SEQIDN0 :14、SEQIDN0:15或SEQIDN0:16至 少约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%相同或完全相同的氨基 酸序列。
[0083]在另一个实施方式中，可用于本发明提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物，包含免疫球蛋白轻链可变区（VL结构域）、基本由其组成或由其组成， 其中除了 1、2、3、4或5个保守氨基酸取代以外，所述VL结构域的至少一个⑶R具有与SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:16完全相同的氨基酸序列。
[0084]在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片 段、变体或衍生物的包含VL结构域、基本由其组成或由其组成，该VL结构域具有与SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18至少约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约 95 %、约96 %、约97 %、约98%、约99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗体包含 特异性或优先结合SEMA4D的编码VL结构域。
[0085]本文提供的方法中使用的还包括编码本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合 片段、变体或衍生物的多肽，编码这类多肽的多核苷酸，包含这类多核苷酸的载体，和包含 这类载体或多核苷酸的宿主细胞，全部用于产生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗体，或其 抗原结合片段、变体或衍生物。
[0086]本发明抗-SEMA4D抗体的合适生物活性变体可用于本发明方法。这种变体将保持 母体抗-SEMA4D抗体的所需结合性质。本领域中制备抗体变体的方法通常是可得的。
[0087]诱变和改变核苷酸序列的方法为是本领域中熟知的。参见例如，Walker和Gaastra 编（1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》）（纽约麦克米兰出版公 司（MacMillan Publishing Company));Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492 (1985) ;Kunkel等，Methods Enzymol · 154:367-382( 1987);Sambrook等（1989)《分子克隆： 实验室手册》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(纽约州冷泉港（Cold Spring Harbor，N.Y.));美国专利号4,873，192;以及其中引用的参考文献;其通过引用纳入本文。 有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型： Dayhoff等（1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图 册》）（华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(Natl .Biomed.Res .Found.，Washington， D.C.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。Dayhoff等的模型利用单点可接受突变 (Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩阵(PAM 250矩阵）来确定合适的保守性氨 基酸取代。在一些方面中，氨基酸取代可以是保守性取代，如用一个氨基酸交换具有类似性 质的另一个氨基酸。Dayhoff等模型的PAM 250矩阵中教导的保守性氨基酸取代的示例包括 但不限于：Oly^Ala '、ValoIle'^Leu、AspeGlu .、Lys^Arg、和 PheOT.rpHTyr 〇
[0088] 构建所述抗-SEMA4D结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、感兴趣多肽时，生 成修饰，从而变体持续拥有所需属性，如能特异性结合SEMA4D，如人、灵长动物、鼠、或者人 和鼠的SEMA4D，例如在表面上表达或由细胞分泌，并具有SEMA4D阻断活性，如本文所述。编 码变体多肽的DNA中产生的突变不应该将序列置于阅读框外，并且在某些方面中将不产生 可生成二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号75,444。
[0089] 测定抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合特异性 的方法包括但不限于:标准竞争结合实验、T细胞或B细胞的免疫球蛋白分泌的监测试验、T 细胞增殖实验、凋亡实验、ELISA实验等。参见例如，W0 93/14125;Shi等，1臟1111^7 13:633-642(2000);Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002);Watanabe等，J Immunol 167： 4321-4328(2001);Wang等，Blood 97:3498-3504(2001);和Giraudon等，J Immunol 172 (2): 1246-1255(2004)公开的实验，其都通过引用纳入本文。
[0090] 本文在讨论本文公开的任何具体多肽(包括恒定区、CDR、VH结构域或VL结构域)是 否与另一多肽至少约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约 93%、约94%、约95%、约96%、约97 %、约98%、约99%或者甚至约100%相同时，相同性％ 可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星 序列分析软件包，用于Unix系统的第8版，遗传学计算机团队(Genetics Computer Group)， 威斯康星州麦迪逊科学大道575大学研究园（University Research Park)，53711)。 BESTFIT利用Smith和Waterman( 1981 )Adv · Appl .Math · 2:482-489的局部同源性算法，以找 到两条序列之间的最佳同源性区段。使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定某具体 序列是否与本发明所述参考序列(例如)95%相同时，当然要设定参数从而在参考多肽序列 的全长上计算相同性百分数，并且在参考序列的氨基酸总数中允许多至5%的同源性缺口。
[0091] 出于本发明的目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法测 定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分， BL0SUM矩阵计62分。Smith和Waterman( 1981 )Adv. Appl .Math.2:482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。变体与参照抗CXCL13抗体(例如，MAb VX15/2503、67或76)可以差 异例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、 或者甚至1个氨基酸残基。
[0092] "序列相同性"百分比也可通过比较对比窗中两种最优比对序列来测定。为了最优 比对用于比较的序列，对比窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含称为缺口的添加或缺 失，而参考序列保持不变。最优比对是即使有缺口仍在参考和比较序列之间产生最大可能 数目的"相同"位置的比对。两种序列之间的"序列相同性"百分比可用程序"BLAST 2序列" 版本测定，所述程序2004年9月1日起可获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，包括程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多 肽序列比较），基于Karl in和Alt schul 的算法（Proc · Natl .Acad .Sci.USA 90(12):5873-5877，1993)。使用"BLAST 2序列"时，2004年9月1日起的标准参数可用于字长(3)、缺口开放 罚分(11)、延伸缺口罚分(1)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的参数，包括但不 限于基质选择。
[0093]可以多种方式使抗-SEMA4D抗体的恒定区突变从而改变效应物功能。例如，参见美 国专利号6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了优化抗体与Fc受 体结合的Fc突变。
[0094]在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物中，可使用本 领域已知的技术突变Fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点 突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况 中，与本发明一致的恒定区修饰调节互补结合并因此缩短血清半衰期。可利用恒定区的其 它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，能因抗原特异性或抗体灵活性提高而加强定位。无 需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所产生的生理学概 况、生物利用度和其它生化作用，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。用于本文提供的方 法的抗-SEMA4D抗体包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，从 而该共价连接不会防止抗体特异性结合其关联表位。例如但不限于，抗体衍生物包括通过， 例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连 接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰， 包括但不限于:特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典 氨基酸。
[0095] "保守性氨基酸取代"是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。 本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括:具有碱性侧链的 氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸）、具有不 带电极性侧链的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨 酸）、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸）、具有分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链 的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。或者，突变可沿着编码序列的全部或部分 随机导入，如通过饱和突变，并且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如， 在对象，例如癌症患者中结合抗-SEMA4D多肽，以阻断SEMA4D与其受体的相互作用，或减少、 抑制、阻止或延迟对象，例如患有炎性病症或动脉粥样硬化的患者中斑块形成的能力）的突 变体。
[0096] 例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在CDR区内引入突变。导入的突变可以是 沉默或天然错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或有很少的影响。可使用这些突变类 型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体生成。或者，非天然错义突变可改变抗体结合抗 原的能力。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性质的突变体分子，如没有抗原结 合活性或结合活性的变化(例如，改善抗原结合活性或改变抗体特异性）。诱变之后，编码的 蛋白质可经常规表达并且能使用本文所述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术来 确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合SEMA4D多肽的至少一个表 位的能力）。
[0097]在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包含至少一个优化的 互补决定区（CDR)。"优化的⑶R"指该⑶R已经修饰并且经优化以提高包含优化的⑶R的抗- SEMA4D抗体的结合亲和性和/或抗-SEMA4D活性。"抗-SEMA4D活性"或"SEMA4D阻断活性"可 包括调节下列一种或多种SEMA4D相关活性的活性:B细胞活性、聚集和存活;CD40-诱导的增 殖和抗体产生;对T细胞依赖抗原的抗体应答;T细胞或其他免疫细胞增殖;树突细胞成熟； 脱髓鞘和轴突变性;多潜能神经前体和/或少突细胞的凋亡;诱导内皮细胞迀移;抑制自发 性单核细胞迀移;与细胞表面丛蛋白B1或其他受体结合，或者与可溶性SEMA4D或SEMA4D+细 胞表面上表达的SEMA4D相关的任意其他活性。抗-SEMA4D活性也可导致与SEMA4D表达相关 的疾病的发病或严重性降低，包括但不限于某些类型的癌症包括淋巴瘤，自身免疫疾病，炎 性疾病包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生 成。基于鼠抗-SEMA4D MAb BD16和BB18的优化的抗体的示例描述于美国专利公开号2008/ 0219971A1、国际专利申请号WO 93/14125和Herold等，Int. Immunol .7(1): 1-8(1995)，其各 自通过引用全文纳入本文。修饰可包括取代CDR内的氨基酸残基，使得抗-SEMA4D抗体保留 对SEMA4D抗原的特异性并且具有改善的结合亲和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。
[0098] IV.使用治疗性抗-SEMA4D抗体的治疗方法
[0099]本发明的方法涉及抗-SEMA4D结合分子，例如抗体，包括其抗原结合片段、变体和 衍生物治疗患有动脉粥样硬化的对象中的动脉粥样硬化的用途。在某些实施方式中，内皮 细胞表达SEMA4D受体，在某些实施方式中，该受体是丛蛋白-B1。虽然以下说明涉及给予抗-SEMA4D抗体，本文所述的方法也适用于保留本发明抗-SEMA4D抗体的所需性质的这些抗体 的抗原结合片段、变体和衍生物，所述性质例如，能够特异性结合SEMA4D，例如，人、小鼠、或 人和小鼠 SEMA4D，具有SEMA4D中和活性，和/或阻断SEMA4D与其受体，例如丛蛋白-B1的相互 作用。本文所述的方法也适用于保留本发明抗体的所需性质的其他生物产品或小分子药 物，例如，能够特异性结合SEMA4D，例如，人、小鼠、或人和小鼠 SEMA4D，具有SEMA4D中和活 性，和/或阻断SEMA4D与其受体的相互作用。
[0100]在一个实施方式中，治疗包括向患者施加或给予本文所述的抗-SEMA4D结合分子， 例如抗体或抗原结合片段，其中该患者患有，或处于发展冠状动脉疾病的风险中。在另一个 实施方式中，治疗也包括向患者施加或给予包含抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结 合片段的组合物，其中该患者患有，或处于发展冠状动脉疾病的风险中。
[0101] 本文所述的抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段可用于治疗炎性疾 病，包括动脉粥样硬化。在一些实施方式中，动脉粥样硬化的治疗可减少、抑制、阻止和/或 延迟动脉粥样硬化斑块的形成和/或减少、抑制、阻止和/或延迟动脉粥样硬化斑块的生长。 动脉粥样硬化斑块由脂肪、胆固醇、钙和其他血液中发现物质构成，其随着时间使动脉硬化 并变窄，从而显示富氧血液流向器官和身体的其他部分。
[0102] 在其他实施方式中，动脉粥样硬化的治疗可减少或降低在动脉粥样硬化斑块中或 周围出现的新血管形成。人主动脉和冠状动脉的动脉粥样硬化斑块中出现新血管形成 (Carmeliet P，Nature Med 9:653-660,2003;和Zhang Y等，Am J Pathol 143:164-172， 1993)。这些心血管源自外膜滋养血管并且用于滋养增厚的动脉粥样硬化内膜生长 (Kumamoto Μ等，Hum Pathol 26:450_456，1995)。因此，新血管形成是动脉粥样硬化斑块生 长和不稳定的主要原因 （Barger AC等，N Engl J Med 310:175-177,1984)。几项研究探索 了新血管形成促进粥样斑形成的机制(Moreno PR等，Circulation 113:2245-2252,2006; 和Cheng XW等，Hypertension 57:981-989，2011)。由于滋养血管的密度与渗透进入斑块的 炎性单核细胞的数量高度相关，认为斑块中新血管的形成提供了白细胞迀移进入动脉粥样 硬化斑块的关键进入位点（O'Brien ER等，Am J Pathol 145:883-894,1994;和Moulton KS 等，Proc Natl Acad Sci USA 100:4736-4741,2003)。来自斑块新血管的出血还通过帮助 血液脂质沉积在粥样斑的脂质核心上来扩大斑块尺寸（Kolodgie FD等，N Engl J Med 349:2316-25，2003)。包括血管抑制素或TNP-4570的动脉粥样硬化抑制剂已经在有动脉粥 样硬化倾向的载脂蛋白E-缺陷型(ApoE-/-)小鼠中显示通过减少新血管形成来抑制斑块生 长，这表明新血管形成在动脉粥样硬化进展中的功能重要性(Moulton KS等，Proc Natl Acad Sci USA 100:4736-4741，2003;和Moulton KS等，Circulation 99:1726-32，1999)〇 此外，在动脉粥样硬化斑块中形成的新血管可通过增加从血液中分泌到斑块的金属蛋白酶 的量来加剧动脉粥样硬化，并最终诱导斑块破裂和血栓形成（Jonsson-Rylander AC等， Arterioscler Thromb Vase Biol 25:180-185,2005)。
[0103]在其他实施方式中，本文所述的抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段 可用于治疗其他炎性疾病。这类疾病的示例可包括，但不限于，心血管疾病、类风湿性关节 炎、胃肠道疾病、神经炎性疾病(例如，多发性硬化)甚至某些类型的癌症(例如，胆囊癌）。 [0 104]在一个实施方式中，本发明涉及抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片 段、变体或衍生物作为药物具体用于治疗或预防动脉粥样硬化以抑制、减少、防止、最小化 和/或延迟动脉粥样硬化斑块的形成和/或抑制、减少、防止、最小化和/或延迟动脉粥样硬 化斑块中的新血管形成的用途。
[0105] 按照本发明的方法，对于动脉粥样硬化，利用至少一种抗-SEMA4D结合分子，例如 本文另述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物提高积极治疗响应。动脉粥样硬化的"积 极治疗响应"包括与斑块形成、斑块新血管形成、斑块生长和/或与疾病相关的症状的改善 相关的疾病改善。即，可观察到延迟的动脉粥样硬化斑块形成、减少的斑块的新血管形成、 减少的炎症、降低的斑块生长、其组合等。这种积极治疗响应不仅限于给药途径，可包括给 予供体、供体组织(如器官灌注）、宿主、其任何组合等。具体地，本文提供的方法涉及抑制、 防止、减少、缓解或减弱患者中动脉粥样硬化的发展。因此，例如，疾病的改善的特征是没有 临床上可观察到的症状，斑块形成或斑块生长的减少、抑制、阻止和/或延迟，新血管形成的 减少、抑制、阻止和/或延迟，炎症减少，或斑块功能或形态变化。
[0106] 抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可与至少一种 或多种其他动脉粥样硬化的治疗联用；其中其他疗法在抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或 其抗原结合片段、变体或衍生物疗法之前、期间或之后给予。因此，在组合疗法包括给予抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与给予另一种治疗的情况 中，本发明的方法包括共同给予、使用单独制剂或单一药物制剂，同时或以任意顺序连续给 予。
[0107] 在某些实施方式中，为了应用本发明的方法和系统，可在向患有动脉粥样硬化或 炎性疾病的对象给予包括以下的治疗之前、之后、或之前和之后同时从对象获得样品或图 像：（1)有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子;或(2)有效量的特 异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子。在一些情况中，可在已经开始治疗之 后或已经停止治疗之后，或在治疗之前和之后从患者获得连续样品或图像。样品或图像可 以是，例如，由医疗提供者（例如，医生）或医疗益处提供者所需要，由相同或不同医疗提供 者(例如，护士，医院）或临床实验室获得和/或处理，并且在处理之后，可将结果转送至另一 个提供者、医疗益处提供者或患者。类似地，可由一个或多个医疗提供者、医疗益处提供者 和/或临床实验室进行一个或多个分数的测量/确定、分数之间的比较、分数的评价和治疗 决定。
[0108] 本文所用术语"医疗提供者"是指直接接触或向活的对象(例如人类患者)给药的 个人或机构。医疗提供者的非限制性示例包括医生、护士、技师、治疗师、药师、顾问、替代医 学从业者、医学设备、医生办公室、医院、急救室、诊所、急救中心、替代医学诊所/设备、和提 供关于患者健康状态的全部或任意部分的一般和/或特殊治疗、评价、维持、疗法、医药和/ 或建议的任意其他实体，包括但不限于一般医学、特殊医学、手术、和/或任何其他类型治 疗、评价、维持、疗法、医药和/或建议。
[0109] 在一些方面中，医疗提供者可给予或指示其他医疗提供者给予治疗，包括：（1)有 效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子;或(2)有效量的特异性结合 脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子，其中该对象患有或疑似患有动脉粥样硬化或 炎性疾病。医疗提供者可执行或指示其他医疗提供者或患者进行以下动作:获取样品或图 像、处理样品或图像、提交样品或图像、接收样品或图像、转移样品或图像、分析或测量样品 或图像、定量样品或图像、提供在分析/测量/定量样品或图像之后得到的结果、接收在分 析/测量/定量样品或图像之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个样品 或图像之后得到的结果、提供来自一个或多个样品的比较/分数、获取来自一个或多个样品 或图像的比较/分数、给予治疗(例如，（1)有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的 分离的结合分子;或(2)给予对象有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结 合分子，其中该对象患有，或疑似患有动脉粥样硬化或炎性疾病），开始给予治疗、停止给予 治疗、继续给予治疗、暂时中断给予治疗、增加给予的治疗剂的量、减少给予的治疗剂的量、 继续给予一定量的治疗剂、增加给予治疗剂的频率、降低给予治疗剂的频率、保持治疗剂的 相同给药频率、由至少一种其他治疗或治疗剂取代治疗或治疗剂、将治疗或治疗剂与至少 一种其他治疗或治疗剂组合。
[0110] 在一些方面中，医疗提供者可授权或拒绝例如，收集样品或图像、处理样品或图 像、提交样品或图像、接收样品或图像、转移样品或图像、分析或测量样品或图像、定量样品 或图像、提供在分析/测量/定量样品或图像之后得到的结果、转移在分析/测量/定量样品 或图像之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个样品或图像之后得到的 结果、转移来自一个或多个样品或图像的比较/分数、给予治疗或治疗剂、开始给予治疗或 治疗剂、停止给予治疗或治疗剂、持续给予治疗或治疗剂、暂时中断给予治疗或治疗剂、增 加给予的治疗剂的量、减少给予的治疗剂的量、继续给予一定量的治疗剂、增加给予治疗剂 的频率、降低给予治疗剂的频率、维持治疗剂的相同给药频率、由至少一种其他治疗或治疗 剂取代治疗或治疗剂、或将治疗或治疗剂与至少一种其他治疗或治疗剂组合。
[0111] 另外，医疗益处提供者可以，例如授权或拒绝治疗处方，授权或拒绝治疗覆盖范 围，授权或拒绝治疗成本的退还，确定或拒绝治疗合格性等。
[0112] 在一些方面中，临床实验室可以，例如，收集或获取样品、处理样品、提交样品、接 收样品、转移样品、分析或测量样品、定量样品、提供在分析/测量/定量样品之后得到的结 果、接收在分析/测量/定量样品之后得到的结果、比较/评分在分析/测量/定量一个或多个 样品之后得到的结果、提供来自一个或多个样品的比较/分数、获取来自一个或多个样品的 比较/分数、或其他相关活动。
[0113] 在一些方面中，医疗提供者、临床实验室、或其他实体可以，例如，收集或获取图 像、处理图像、提交图像、接收图像、转移图像、分析或测量图像、定量图像、提供在分析/测 量/定量图像之后得到的结果、接收在分析/测量/定量图像之后得到的结果、比较/评分在 分析/测量/定量一个或多个图像之后得到的结果、提供来自一个或多个图像的比较/分数、 获取来自一个或多个图像的比较/分数、或其他相关活动。可用于这些方面的成像包括但不 限于通过冠状血管造影、血管内超声（IVUS)、颈动脉超声、冠状动脉计算机断层扫描(CT)、 核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)光学相干断层成像（0CT)、近红外光谱 (NIRS)、和NIR荧光获得的图像。在某些实施方式中，可使用已经在文献中描述的成像技术 (Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging 4:319-333(2011))。
[0114] VII.诊断和治疗方法
[0115] 在某些实施方式中，本发明提供了治疗对象，例如动脉粥样硬化患者的方法，其中 该对象具有升高水平的B细胞、T细胞或B细胞和T细胞，该方法包括如果该对象的B细胞、T细 胞或B细胞和T细胞水平超过B细胞、T细胞或B细胞和T细胞的预定阈值水平，或者相对于一 个或多个对照样品中的B细胞、T细胞或B细胞和T细胞水平升高，则给予有效量的特异性结 合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子，对照样品可包括但不限于来自其他动脉粥 样硬化患者或来自健康非动脉粥样硬化患者的样品。可由医疗提供者或临床实验室测量B 细胞、T细胞或B细胞和T细胞水平，其中由医疗提供者或临床实验室从患者获取样品，例如， 血液样品。在一个方面中，可在基于流式细胞术的免疫表型试验中测量患者的B细胞、T细胞 或B细胞和T细胞的水平。
[0116] 在某些实施方式中，本发明也提供了治疗对象，例如动脉粥样硬化患者的方法，该 方法包括:如果取自该对象的样品中的C-反应蛋白（CRP)和/或低密度脂蛋白（LDL)水平高 于上述预定阈值水平，或者相对于一个或多个对照样品中的CRP和/或LDL水平升高，则向该 对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子。可由医疗提供 者或由临床实验室测量对象中的CRP和/或LDL水平表达。在某些方面中，可通过例如成像技 术在原位测量CRP和/或LDL水平。在某些方面中，可在获自对象的样品中测量CRP和/或LDL 水平表达。在一个方面中，可在采用识别CRP和/或LDL的抗体或其抗原结合片段的免疫试验 中测量CRP和/或LDL水平。在另一个方面中，可通过定量基因表达试验，例如RT-PCR试验来 测量CRP和/或LDL水平。
[0117] 本发明还提供了方法、试验和试剂盒来促进由医疗提供者、医疗益处提供者或临 床实验室确定对象，例如患有动脉粥样硬化或炎性疾病的患者是否将受益于用以下治疗： (1)有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子;或（2)有效量的特异 性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合分子，其中该对象患有或疑似患有动脉粥样 硬化或炎性疾病。本发明提供的方法、试验和试剂盒还将促进由医疗提供者、医疗益处提供 者或临床实验室确定对象，例如患有动脉粥样硬化或炎性疾病的患者是否将受益于以下治 疗：（1)有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子和有效量的至少一 种其他免疫调节治疗剂;或(2)有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的结合 分子。
[0118] 本发明提供了治疗对象，例如动脉粥样硬化患者的方法，该方法包括如果取自该 患者的样品中的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平高于预定阈值水平，或者高于一个或 多个对照样品中的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平，则给予有效量的特异性结合脑信 号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子。在一些方面中，从患者获取样品并且提交至例如临 床实验室来测量样品中B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平。
[0119] 本发明还提供了一种治疗确定患有动脉粥样硬化斑块的对象，例如患有动脉粥样 硬化的患者的方法，包括给予有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合 分子。在某些实施方式中，如果患者中动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征大于预定阈值 数量、尺寸或特征，或如果对象中动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征与一个或多个对照 样品相比时指示动脉粥样硬化，则确定对象有动脉粥样硬化斑块并接受治疗。在一些方面 中，从患者获取样品并且提交至例如临床实验室来测量样品中CRP和/或LDL的水平。在其他 方面中，患者经过成像技术以确定动脉粥样硬化斑块的数量、尺寸或特征。可用于这些方法 的成像包括但不限于通过冠状血管造影、血管内超声（IVUS)、颈动脉超声、冠状动脉计算机 断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正电子发射断层成像(PET)光学相干断层成像(0CT)、 近红外光谱(NIRS)、和NIR荧光获得的图像。在某些实施方式中，可使用已经在文献中描述 的成像技术（Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging. 2011 ;4:319-333)。在某些实施方式中， 如果动脉粥样硬化斑块是具有特征的"易感的动脉粥样硬化斑块"，则给予治疗，该特征包 括但不限于大脂质核、低SMC含量、高巨噬细胞含量、和薄纤维帽。可通过评分系统(Virmani 等，Arterioscler Thromb Vase Biol 20(5): 1262-75(2000))或其他技术（van Lammeren 等，Current Cardiology Reviews 7:22-27(2011))来确定对象中存在"易感的动脉粥样硬 化斑块"。在某些实施方式中，按照本文提供的方法治疗确定具有这类"易感的动脉粥样硬 化斑块"的对象。
[0120] 还提供了一种治疗对象，例如动脉粥样硬化患者的方法，该方法包括：（a)提交取 自该对象的样品来测量样品中B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平，或测量CRP和/或LDL; 和(b)如果该对象的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平、或该对象的CRP和/或LDL水平高 于预定阈值水平，或者高于一个或多个对照样品中的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水 平、或CRP和/或LDL的水平，则给予该对象有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D( SEMA4D)的 分离的结合分子。
[0121] 本发明还提供了治疗对象，例如动脉粥样硬化患者的方法，该方法包括(a)测量取 自对象，例如动脉粥样硬化患者的样品中B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平，其中在基 于流式细胞术的免疫表型试验中测量样品中的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平；（b) 确定样品中B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平是否高于预定阈值水平，或者高于一个或 多个对照样品中的B细胞、T细胞、或B细胞和T细胞的水平；和（c)如果该对象的B细胞、T细 胞、或B细胞和T细胞的水平高于预定阈值水平，或者高于一个或多个对照样品中的B细胞、T 细胞、或B细胞和T细胞的水平，则建议、指示或授权医疗提供者向该对象给予有效量的特异 性结合脑信号蛋白-4D (SEMA4D)的分离的结合分子。
[0122] 在一些方面中，可在基于流式细胞术的免疫表型试验中测量对象的B细胞、T细胞、 或B细胞和T细胞的水平。在某些方面中，可通过医疗专业人员用例如本文所述的试验配制 成"医疗点"诊断试剂盒对取自对象的样品进行试验。在一些方面中，可从对象获取样品并 且可提交至例如临床实验室来按照医疗专业人员的说明测量样品中B细胞、T细胞、或T细胞 和Β细胞的水平，包括但不限于使用本文所述的基于流式细胞术的免疫表型试验。在某些方 面中，临床实验室所进行的试验可建议医疗提供者或医疗益处提供者如果取自该患者的样 品中的Β细胞、Τ细胞、或Β细胞和Τ细胞的水平高于预定阈值水平，或者高于一个或多个对照 样品中的Β细胞、Τ细胞、或Τ细胞和Β细胞的水平，对象是否受益于用有效量的特异性结合脑 信号蛋白-4D (SEMA4D)的分离的结合分子。
[0123] 在某些方面中，免疫试验、其他诊断试验和/或成像的结果可提交至医疗益处提供 者来确定患者的保险是否覆盖用特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子的 治疗。
[0124] VIII.药物组合物和给药方法
[0125] 本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗 原结合片段、变体或衍生物的方法。抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或 衍生物的给药途径可以是，例如，口服、胃肠道外、吸入或外用。本文所用的术语"胃肠道外" 包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然所有这些给药形式 均明确认为在本发明范围内，但给药形式的例子是注射液，特别是用于静脉内或动脉内注 射或滴注。合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂）、 表面活性剂(如聚山梨酯），以及任选的稳定剂(如人白蛋白）等。然而，在与本文所教授内容 相符的其它方法中，抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接 递送到不良细胞群的位点，从而提高患病组织与治疗剂的接触。
[0126] 如本文所述，可以药学有效量给予抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合 片段、变体或衍生物用于体内治疗炎性病症。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合 分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含 药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。出于本申请目的， 抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量应认为指足以 实现有效结合靶标和足以实现某一益处例如减少、抑制、阻止和/或延迟动脉粥样硬化患者 中斑块形成或生长的量。
[0127] 本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体，包括例如，离子交换剂、氧 化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、 山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢 二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、 聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊 毛脂。
[0128] 胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示 例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括例 如，水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的运载体 包括但不限于:〇. 01-0.1M，例如0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8 %盐水。其它常见的胃肠道外 载剂包括磷酸钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂 包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐 剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0129] 更具体地，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时）或分散液，以 及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须无菌，并应 该是达到存在注射容易性(easy 871*;[1^313；[1;^7)程度的流体。它应该在制造和储存条件下 稳定，并且在一些方面中应该在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运 载体可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物 的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下 通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见《雷 明顿药物科学》（Remingtor/s Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司（Mack Publishing Co·))第16版（1980)。
[0130] 也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、 硫柳汞等)实现防止微生物的作用。在某些方面中，药物组合物可包含等渗剂，例如，糖、多 元醇，如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明 胶）以延长可注射组合物的吸收。
[0131] 在任何情况下，制备无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(如抗-SEMA4D抗 体或其抗原结合片段、变体或衍生物，本身或与其它活性剂联合)掺入含有本文所列一种成 分或多种成分组合的合适溶剂，然后如需要进行过滤除菌。通常，将活性活化物掺入含有碱 性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在制备无菌注射液所需的无菌 粉末时，在一些方面中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，由之前无菌过滤的溶液得到活 性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工，装 入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小管）中，并密封。此外，可以试剂盒的形式包装并销售制 剂。这类制品可具有标签或药品说明书，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有疾 病或病症的对象。
[0132] 胃肠道外制剂可以是单次推注剂量，输注或负荷推注剂量，随后是维持剂量。可在 具体固定或可变的间隔处给予这些组合物，例如，每天一次或者"按需"基础。
[0133] 本发明所用的某些药物组合物可以可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片 剂、水性悬液或溶液。也可通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。这类组合物可采用 苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促经济以增强生物可及性，和/或其他常规增溶剂或分散 剂制备成盐水溶液。
[0134] 与载体材料组合产生单一剂型的抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其片段、变体或衍 生物的量可以根据治疗宿主以及具体的给药模式而变化。可以单剂型、多剂型或在确立的 时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预 防性响应)。
[0135] 在本发明范围内，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可按照上述治 疗方法给予人或其它动物，其给予量足以产生疗效。本发明抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合 片段、变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型根据已知技术将本发明 抗体与常规的药学上可接受运载体或稀释剂混合来制备。本领域技术人员应认识到，药学 上可接受运载体或稀释剂的形式和特点由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量 决定。本领域技术人员还将理解，可使用包含一种或多种抗-SEMA4D结合分子，如本发明的 抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物。
[0136] "治疗有效剂量或量"或"有效量"是指抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结 合片段、变体或衍生物的量，其在给予时带来对于患有待治疗疾病的患者的治疗的积极治 疗响应，例如，动脉粥样硬化斑块形成的延迟;新动脉粥样硬化斑块形成增加的减少、延迟 或停止;抑制，例如，阻止、延迟、防止、停止或逆转动脉粥样硬化斑块中的新血管形成;动脉 粥样硬化斑块形态或功能变化;或一定程度上释放与动脉粥样硬化相关的症状中的一种或 多种;降低发病率和死亡率;改善生活质量;或这类效果的组合。
[0137] 用于减少、抑制、阻止和/或延迟动脉粥样硬化斑块的本发明的组合物的治疗有效 剂量可根据许多不同的因素变化，包括给药方式、目标位点、患者的生理状态、患者是人还 是动物、给予的其他药物和治疗是预防性还是治疗性。在某些实施方式中，患者是人，但也 可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治 疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。
[0138] 鉴于本发明的公开内容，本领域普通技术人员无需过多实验即可确定至少一种 抗-SEMA4D结合分子如抗体或其结合片段、变体或衍生物的给予量。影响给药方式以及至少 一种抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物各自用量的因素包括但 不限于:接受治疗的个体的疾病严重程度、病史、年龄、身高、重量、健康和身体状况。类似 地，抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其片段、变体或衍生物的给予量取决于给药方式、对象是 否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。
[0139] 本发明还提供抗-SEMA4D结合分子，例如本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体 或衍生物在制备用于治疗患有炎性病症的对象的药物中的用途，其中该药物用于已经用至 少一种其他治疗预治疗的对象。"预治疗"或"预处理"是指对象在接受包含抗-SEMA4D结合 分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前已经接受了一种或多种其他治 疗（例如，已经用至少一种其他炎症治疗进行治疗）。"预治疗"或"预处理"包括在开始用包 含抗-SEMA4D结合分子，例如本文公开的单克隆抗体VX15/2503或其抗原结合片段、变体或 衍生物的药物治疗开始2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、 3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或者甚至1天内已经用至少一种其 他治疗进行治疗的对象。对象不必对用之前的一种或多种治疗进行的预治疗有响应。因此， 接受包含抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的对象可 能已经响应或可能没有响应用先前治疗的预治疗，或先前治疗中的一种或多种，其中预治 疗包括多种治疗。
[0140] 除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因 生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在 文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编（1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆：实验室手册》）（第2版；冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook等编（1992)Molecular Cloning： A Laboratory Manual (《分子克隆：实验室手册》），（纽约州的冷泉港实验室出版社（Cold Springs Harbor 1^13〇1&1:〇巧，阶））；0.1^.61〇￥61'编，（1985)0嫩（]1〇11；[叫（《0财克隆》），第1和11卷；6&;[1:编 (1984)01丨801111(31601:丨(16 37111:1168丨8(《寡核苷酸合成》）；11111丨8等，美国专利号4,683，195; Hames和Higgins编（1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》）；Hames和Higgins编 (1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》）；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》）（ARL公司（Alan R.Liss，Inc.));Immobilized Cells And Enzymes(《固定的细胞和酶》）（IRL出版社）（1986) ;Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》） (学术出版社公司（Academic Press，Inc.)，纽约州）；Miller和Calos编（1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》）（冷泉港实验室 出版社（Cold Spring Harbor Laboratory) );Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方 法》），第154和155卷；Mayer和Walker编（1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Bio logy (《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》）（学术出版社(Academic Press)，伦敦）；Weir和Blackwell编（1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验 免疫学手册》），第I-IV卷;Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》），纽约州冷 泉港的冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor， N.Y·)，（1986);和Ausubel等（1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分 子生物学实验指南》）（马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司（John Wiley&Sons， Baltimore?Md.))0
[0141 ] 抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编（1995) Anti body Engineering (《抗体 工程》）（第2版；牛津大学出版社（Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见 Rickwood等编（1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方 法》），（英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司（IRL Press at Oxford Univ.Press， 0xford，Eng.)) 抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见:Nisonoff (1984)Molecular Immunology (《分子免疫学》）（第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司（Sinauer Associates，Sunderland，Mass·));和Steward(1984)Antibodies，Their Structure and Function(《抗体的结构和功能》）（Chapman和Hall，纽约州纽约市）D此外，本领域已知且没 有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》），纽约州的约翰韦利父子公司（John Wiley&Sons); Stites等编（1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》）（第8版； Apple ton 和 Lange，康捏狄格州的诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishe 11 和Shi igi (编）（1980) Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》）(W.Η.弗里曼公 司(W.H.Freeman and Co)，纽约州）。
[0142] 列出免疫学通用原理的标准参考文献包括:Current Protocols in Immunology (《新编免疫学实验指南》），约翰韦利父子公司（John Wiley&Sons)，纽约州;Klein(1982) J. ?Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination^〈免疫学：自身-非自身 区别的科学》）（约翰韦利父子公司，纽约州）；Kennett等编（1980)Monoclonal Antibodies， Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分 析的新领域》）（普莱努公司（Plenum Press)，纽约州）；Campbell (1984)〃Monoclonal Antibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的"单克隆抗体技术"），Burden等编（的埃尔 斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹）；Goldsby等编（2000)Kuby Immunnology(《库比免疫 学》）（第4版;H.弗里曼公司（H.Freemand&Co.)) ;Roitt等（2001)Immunology(《免疫学》）（第 6版；伦敦：摩兹比公司（Mosby));Abbas等（2005)Cellular and Molecular Immunology (《细胞和分子免疫学》）（第5版;埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health Sciences Division)) ;Kontermann和Dubel(2001 )Antibody Engineering(《抗体工程》）（施普林格公 司（Springer Verlan));Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual (《分子克隆：实验室手册》）（冷泉港出版社（Cold Spring Harbor Press) );Lewin (2003)Gene VIII(《基因普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003);Harlow和 Lane( 1988)Antibodies :A Laboratory Manual (《抗体：实验室手册》）（冷泉港出版社）； Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》）（冷泉港出版社）。
[0143] 将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入 本文。
[0144] 通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。 实施例
[0145] 实施例1:测试抗-SEMA4D结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物， 例如VX15/2503在ApoE-缺陷型自发性高脂血症(SHL)小鼠中抑制动脉粥样硬化形成并减少 新血管形成的能力
[0146] 实验设计。以下实验检验用抗-Sema4D阻断抗体治疗ApoE-缺陷型自发性高脂血症 (SHL)小鼠是否降低斑块生长和新血管形成。
[0147] 小鼠。遗传背景为0578176,0578176.1(01?/5加 51(3-4口〇641的雄性4口(^-缺陷型自 发性高脂血症（SHL)小鼠获自日本静冈县的日本SLC公司（Japan SLC，Inc ·( Shizuoka， Japan))。用正常饮食饲喂SHL小鼠并饲养在名城大学药学系的动物中心。所有的实验方案 得到机构动物伦理审查委员会的批准。
[0148] 小鼠的抗体治疗。雄性14周龄的SHL小鼠被随机分配到2个组中并且各组通过腹膜 内注射以〇. 6mg/小鼠每周一次给予小鼠对照单克隆抗体(n= 10)(对照抗体2B8.1E7，纽约 州罗彻斯特的瓦西尼斯公司（Vaccinex，Inc .，Rochester，NY))或小鼠抗-SEMA4D中和单克 隆抗体(n = 9)(VX15/67-2,瓦西尼斯公司）。在12周的治疗之后，处死小鼠。
[0149] 组织处理。通过插入左心室尖部的21号针头使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌注小鼠 主动脉持续3分钟，然后用4%缓冲的多聚甲醛(pH 7.4)另外灌注3分钟。带有其主要分支点 (头臂动脉干、左颈总动脉和左锁骨下动脉）的主动脉弓以及胸主动脉和腹主动脉被切下并 在4%缓冲的多聚甲醛(pH 7.4)中固定。然后用苏丹IV(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich，St .Louis，M0))对主动脉染色以揭示嗜苏丹脂质沉积并且 使用Image J软件(Wayne Rasband，马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院（NIH，Bethesda， MD))来对脂质斑块面积占总主动脉面积的百分比进行定量(Dougherty A等，Methods in Molecular Biology，卷209:Transgenic Mouse Methods and Protocols(《转基因小鼠方 法和方案》），新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司(Humana Press Inc.，Totowa，NJ)，第293-309 页，2002)。
[0150] 免疫组化和形态计量学。从麻醉的小鼠中切下的主动脉弓在4%缓冲的多聚甲醛 (pH 7.4)中固定。所有血管纵向包埋于石蜡中并切成1-μπι连续切片。用抗-小鼠⑶31抗体 (美国新泽西州富兰克林湖市的BD公司（BD，Franklin Lakes，NJ))对切片进行免疫标记以 对内皮细胞进行染色。随后用偶联二抗的葡聚糖聚合物和过氧化物酶（日本京都的DC公司 (DakoCytomation，Kyoto，Japan))孵育它们。为了检测新血管形成，在室温下用10μg/ml蛋 白酶K(日本京都的日本生命技术公司（Life technologies Japan，Tokyo，Japan))预处理 切片15分钟并且在室温下与7.5mg/ml的偶联焚光素酶的来自西非单叶豆（Bandeiraea simpilicifolia)的凝集素 Μ(西格玛-奥德里奇公司)孵育1小时。凝集素 M(IB4)结合至有 内皮细胞表达的末端半乳糖残基。新血管形成的程度确定为通过使用Image-J形态计量 学系统(Wayne Rasband)将凝集素 Μ或CD31-阳性面积除以相应的斑块面积计算的百分比。 [0151 ]统计学分析。数据表示为平均值土 s. Ε。使用斯氏t检验比较抗-Sema4D抗体治疗的 SHL小鼠与对照抗体治疗的SHL小鼠。在*p<0.05，#p<0.01下，数据是统计学显著的。 [0152]抗-Sema4D抗体治疗抑制动脉粥样硬化斑块的发展。为了分析ApoE缺陷型SHL小鼠 中抗-Sema4D抗体治疗对动脉粥样硬化发展的影响，对来自对照抗体治疗和抗-Sema4D抗体 治疗的SHL小鼠的解剖主动脉进行脂质沉积的嗜苏丹染色。图1A显示当与对照抗体治疗的 组比较时，抗-Sema4D抗体治疗的SHL小鼠的主动脉区域中动脉粥样硬化斑块发展受到显著 抑制。如图1A所示，对动脉粥样硬化斑块面积的定量测量显示抗-Sema4D抗体治疗的SHL小 鼠中嗜苏丹面积相对于总主动脉区域的平均百分比明显小于对照抗体治疗的组中的平均 百分比（抗-361^40抗体治疗的小鼠 ：4.89±1.11%对比对照抗体治疗的小鼠：17.64± 3.41%;p = 0.002)。这些发现证明在动脉粥样硬化发展阶段使用抗-SEMA4D抗体阻断 Sema4D活性减少了斑块生长。
[0153]抗-Sema4D抗体治疗的SHL小鼠的动脉粥样硬化斑块中更少的新血管形成。为了研 究动脉粥样硬化斑块中新血管形成，采用凝集素 Μ染色来检测对照抗体治疗的SHL斑块和 抗-Sema4D抗体治疗的SHL斑块中的新血管形成。结果显示，在抗-Sema4D抗体治疗的斑块中 凝集素 Μ阳性染色的百分比明显低于在对照抗体治疗的SHL斑块中的百分比(抗-Sema4D抗 体治疗的SHL小鼠：0.35 ±0.04%对比对照抗体治疗的SHL小鼠：1.70 ±0.24% ;P<0.001， 图 1B)。
[0154] 使用针对⑶31，一种内皮细胞的标记物的抗体的免疫组化也显示与对照抗体治疗 的SHL斑块相比，在抗-Sema4D抗体治疗的SHL斑块中CD31阳性面积明显减少(抗-Sema4D抗 体治疗的SHL小鼠：12.62 ± 1.34 %对比对照抗体治疗的SHL小鼠：19.30 ± 1.22 % ; P = 0.012，图1C)，这强调了在抗-Sema4D抗体治疗的SHL小鼠斑块中弱的新血管形成。
[0155] 这些发现证明在动脉粥样硬化的进展阶段阻断Sema4D活性使新血管形成减少。此 外，它们证明抗-SEMA4D抗体阻断内皮祖细胞向动脉粥样硬化斑块中迀移，这进而导致斑块 新血管形成和斑块生长减少。通过以上描述和相关图所示内容，本发明相关领域技术人员 可以想到本发明的许多改良和其它的实施方式。因此，应当理解本发明不仅限于所公开的 【具体实施方式】，所述改良和其它实施方式也包括在所附权利要求书和所列实施方式的范围 之内。尽管在本发明中使用了具体的术语，但是这些术语仅以通用和描述性意义使用，而不 用于对本发明构成限制。
【主权项】
1. 一种用于在患有动脉粥样硬化的对象中抑制、阻止、减少或延迟动脉粥样硬化斑块 生长的方法，包括向所述对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离的 结合分子。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合分子抑制SEMA4D与其受体的相互作 用。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述受体是丛蛋白-B1或丛蛋白-B2。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1 信号转导。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对象患有心血管疾病。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病选自下组:冠心病(也称为缺 血性心脏病或冠状动脉疾病）、心肌病、高血压心脏病、心力衰竭、肺源性心脏病、心脏节律 障碍、炎性心脏病心内膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎、心脏瓣膜病、脑血管病、外周动脉疾病、 先天性心脏病、风湿性心脏病、及其组合。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子与参照单克隆抗体 VX15/2503或67特异性结合相同的SEMA4D表位。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子竞争性抑制参照单克隆 抗体VX15/2503或67与SEMA4D的特异性结合。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子包括抗体或其抗原结合 片段。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的可变重链 (VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR 1-3,其中VHCDR 1-3分别包含SEQ ID NO: 6、7和8，VLCDR1-3分别包含SEQIDN0:14、15和16。11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO :9和SEQ ID NO: 17或分别包含SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括抑制、延缓、减少或延迟所 述动脉粥样硬化斑块周围的新血管形成。13. 用于在患有动脉粥样硬化的对象中抑制、延缓、减少或延迟新血管形成的方法，包 括向所述对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D)的分离的结合分子。14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述结合分子抑制SEMA4D与其受体的相互 作用。15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述受体是丛蛋白-B1。16. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述结合分子抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。17. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述对象患有心血管疾病。18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病选白下组:冠心病(也称为 缺血性心脏病或冠状动脉疾病）、心肌病、高血压心脏病、心力衰竭、肺源性心脏病、心脏节 律障碍、炎性心脏病心内膜炎、炎性心脏肥大、心肌炎、心脏瓣膜病、脑血管病、外周动脉疾 病、先天性心脏病、风湿性心脏病、及其组合。19. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子与参照单克隆抗体 VX15/2503或67特异性结合相同的SEMA4D表位。20. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子竞争性抑制参照单克 隆抗体VX15/2503或67与SEMA4D的特异性结合。21. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分离的结合分子包括抗体或其抗原结 合片段。22. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的可变重链 (VH)含有VHCDR 1-3且可变轻链(VL)含有VLCDR 1-3,其中VHCDR 1-3分别包含SEQ ID NO: 6、7和8，VLCDR1-3分别包含SEQIDN0:14、15和16。23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 17或分别包含SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。24. -种治疗患有动脉粥样硬化的对象的方法，所述方法包括： 向确定有动脉粥样硬化斑块的对象给予有效量的特异性结合脑信号蛋白_4D(SEMA4D) 的分离的结合分子，从而抑制、延缓、减少或延迟动脉粥样硬化斑块的生长。
【文档编号】A61K39/395GK105848679SQ201480067853
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月10日
【发明人】M·左德勒
【申请人】瓦西尼斯公司