专利名称：一种显微染色鉴别冬虫夏草粉的方法
技术领域：
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及一种显微染色鉴别冬虫夏草粉的方法。
背景技术：
在我国传统的医药中，冬虫夏草一直就是高级滋补品，药用地位十分显著，与人参、鹿茸并称为“三大补品”。随着各相关学科领域的深入研究，近年来不断有虫草新的种类、新的分布的报道，化学成分不断被分离、鉴定，而有关免疫、抗肿瘤等多方面的药理、药效学研究充分证实了冬虫夏草的药效。由于冬虫夏草的特殊生长环境、特殊的地理环境及重要的经济价值，使得人们的研究兴趣倍加强烈，尤其是对冬虫夏草及其代用品的研究更是十分活跃。目前市场流通与销售的纯冬虫夏草粉，由于被制成了一定的剂型，很难区分真伪， 虽然可以用检验仪器的手段，证明冬虫夏草的若干标记物的存在，如虫草素与腺苷的含量， 但这些标记物容易买到，而且并不贵，理论上可以用来作添加剂，所以理化检验既不能检出杂质，也不能辨别赝品。由于虫草粉价格高昂，为了保护消费者的利益，本领域需要建立准确鉴定纯冬虫夏草粉真伪的方法。
发明内容
本发明要解决的是市场流通与销售的纯冬虫夏草粉难于分真伪的技术问题。本发明解决该问题的技术方案是提供一种准确鉴别冬虫夏草粉的方法。该方法包括以下步骤取待检冬虫夏草粉，染色制成涂片；所述染色为分别进行苏木精-伊红-碘液染色、番红-固绿染色、斯氏染液-碘液染色中的至少一种染色；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。其中，本发明鉴别纯冬虫夏草粉的方法中所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种。其中，本发明鉴别纯冬虫夏草粉的方法中所述的冬虫夏草的染色方法为滴加苏木染液IOmin染色后水洗5min，然后依次分别用50 %、75%、95 %乙醇梯度洗，然后滴加伊红染液染色5min，然后滴加碘液染色5min，然后依次分别用50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯度洗漆，后置于二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中，本发明鉴别纯冬虫夏草粉的方法中所述的冬虫夏草的染色方法为将涂片用 50 %乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色，然后依次分别用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用95^^95^^100%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100%乙醇混合液中5 IOmin,再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中，本发明鉴别纯冬虫夏草粉的方法中鉴别冬虫夏草的特有结构时，可以用同种方式染色的具有冬虫夏草特有结构的标准切片为标准。还可以用冬虫夏草的虫体横切片和冬虫夏草子座横切片作为参考标准。以防止检验人员由于经验不足产生误判。其中，本发明鉴别纯冬虫夏草粉的方法中对每批待检的纯冬虫夏草粉物料取样 4 10份。一般取6份进行检测，以提高准确度。对每批待检的纯冬虫的每张涂片中的每 I张上都要有至少4种特有结构才为真品。具体而言，本发明方法可采用以下的详细实施过程取待检冬虫夏草粉4 10份，一般取6份。将取的样染色制成涂片；所述染色为分别进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色、斯氏染液染色中的至少一种染色，并进行碘液染色；其中苏木精-伊红染色的方法为滴加苏木染液IOmin染色后水洗5min，然后依次分别用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗涤，然后滴加伊红染液染色5min，然后滴加碘液染色5min，然后依次分别用50%、75%、95%、100 %的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯液中5 IOmin以完成染色。其中番红-固绿染色的方法为将涂片用50%乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色，然后依次分别用50%、75%、95%乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用95%、95%、100%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100%乙醇混合液中5 IOmin,再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。然后将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种特有结构都能在显微镜下观测到。本发明方法的有益效果在于本发明主要采用显微染色鉴别的思路，针对冬虫夏草的特殊情况，开发出本发明方法。本发明方法通过对冬虫夏草微细结构的染色，经过生物显微镜，在不同的放大倍数下，能清晰辨认细小的饮片粉末和分辨出不属于冬虫夏草的物质。而且该方法成本低、效率高，不易受各种添加成分的干扰，准确度非常高，适用于1500 目以内的超微粉的鉴别观察。可以单独使用以鉴别纯冬虫夏草超微粉，对判断目前市场销售的冬虫夏草超微粉及冬虫夏草制剂的可信度及纯正度有着十分重要的意义。本发明方法可以单独使用确判断珍贵冬虫夏草的真伪，也可以结合其他的冬虫夏草及冬虫夏草超微粉在通过鉴别方法，如虫草性状中形状、色泽、气味与滋味、环纹、虫足的检测；感官品质要求的外观、色泽、气味与滋味；理化指标中对水分、腺苷、杂质、重金属、微生物的检测在判断珍贵冬虫夏草的真伪的基础上确定其质量水平，这对保护消费者的利益有着深远的意义，在本领域有很好的应用前景。
图I为冬虫夏草纵切片(40X)
图2为冬虫夏草横切片。左为冬虫夏草虫体横切片(40X)，右为冬虫夏草子座横切片(40X)。图3为虫体菌丝体(100X)图4为冬虫夏草超微粉-虫体菌丝体(100X)，伊红染液。图5为虫体表皮层(100X)，苏木染液。图6为冬虫夏草超微粉-虫体表皮层(100X)，伊红染液。图7为虫体肌肉组织(100X)，左为苏木染液；右是伊红染液。图8为冬虫夏草超微粉-虫体肌肉组织(100X)，伊红染液下。图9为子座菌丝体(100X)，左为苏木染液下，右是固绿染液下。图10为冬虫夏草超微粉-子座菌丝体(100X)，伊红染液下。图11为子座表皮层(100X)，左为苏木染液下，右边是伊红染液下。图12为冬虫夏草超微粉-子座表皮层(100X)，伊红染液下。图13为碘液染色的淀粉颗粒(100X)图14为苏木染液下植物组织-叶(100X)其中图3、5、7、9、11是指在冬虫夏草整体切片上找到的相应典型结构的部分图片(即图1，图2的局部放大图)。图4、6、8、10、12为待测的冬虫夏草超微粉涂片的结果。
具体实施例方式五、实验方法及参数I.实验样品冬虫夏草切片、市售极草牌纯冬虫夏草超微粉，淀粉超微粉、淀粉超微粉和纯冬虫夏草超微粉的混合物。2.染色剂固绿染液国药集团化学试剂有限公司；番红染液国药集团化学试剂有限公司； 伊红染液沈阳新光化工厂；苏木精染液沈阳新光化工厂；斯氏液北京化工厂；碘南京新化原化学有限公司，按常规方法配成染液。3.仪器或其他用具双筒生物显微镜，照相转接设备，佳能单反相机。酒精灯，载玻片，盖玻片，染色架， 香柏油，无水乙醇，二甲苯，加拿大树胶，擦镜纸，蒸馏水等常规器材。4.流程固定一透明一涂片(装片)—染色一封藏一干燥一镜检。5.步骤5. I 固定取搅拌均匀的样品适量，用蒸馏水浸泡4h，再用FAA(甲醛10%，乙醇50% -75%, 余量为蒸馏水的混合液)固定4-24h。5. 2.透明将固定好的冬虫夏草超微粉经过30 %、50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯度洗涤 (每个步骤洗涤3-5分钟)，置于二甲苯液中10分钟。5. 3.涂片(装片)
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取洁净的载玻片，取透明后的冬虫夏草超微粉适量，混匀并装片，不宜过厚。同法制成六组。取洁净的载玻片，取淀粉超微粉适量，用斯氏液混匀并装片，不宜过厚。同法制成六组。5. 4.染色(I)苏木精-伊红染色。将每种样品六组玻片平放于培养皿内，滴加染液(苏木染液IOmin —水洗 5min — 50 %、75 %、95 % 乙醇洗一伊红染液 5min —碘液 5min — 50 % ,75 % ,95 % UOO %, 100%的乙醇洗涤，置于二甲苯液中lOmin。)I 2滴于相应涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。染色约25-30min。染色结果细胞核被苏木精染为兰色，细胞浆(细胞质)、核仁、肌纤维、胶元纤维、 红细胞等被伊红染成程度不同的鲜红色。浆细胞的分泌颗粒由于它能同时被苏木精和伊红染色故显深紫色。如有淀粉颗粒则染成蓝色颗粒。所用伊红将能将上皮细胞、肌肉纤维和细胞浆染为红色。(2)、番红-固绿染液染色将每种样品六组玻片平放于培养皿内，用(50%乙醇浸泡一番红染液25min —用 50%、75%、95%乙醇洗一固绿Imin — 95%、95%、100%、100%的乙醇洗涤，置于二甲苯与 100%乙醇混合液中5-10min，置于纯二甲苯液中5_10min。)I 2滴于相应涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。染色约25-30min。固绿是酸性染料，能溶于水(溶解度为4% )和酒精(溶解度为9% )。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广，和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。番红可溶解于水和乙醇，通常配成I %水溶液染植物的木质部，也可以按照以下配方配成苯胺番红液对组织进行块染番红5g，95%乙醇 5OmL,苯胺油20mL,蒸懼水450mL。番红能够对植物的木质化、栓质化和胶质化部分进行染色，染色后的部分为红色。染色时间一般为2 24hrs,常与固绿等进行合作染色。(3)斯氏染液-碘液染色将斯氏液混匀的样品六组玻片平放于培养皿内，滴加碘液5min — 50 %、75 %、 95% > 100%、100%的乙醇洗漆,置于二甲苯与100%乙醇混合液中5 IOmin,置于二甲苯液中5 IOmin05. 5 封藏从二甲苯溶液中取出载玻片，在有粉末的位置处滴加1-2滴加拿大树胶溶液，加盖玻片封藏。5. 6 干燥将封藏好的载玻片，自然干燥、电吹风吹干或用恒温烤箱40°C _50°C烘干(温度不能太闻)。5. 7 镜检玻片干后镜检。用双目生物显微镜或数码生物显微镜在不同倍数下观察每种样品的结构(鉴定真假冬虫夏草)。如用油镜观察，则玻片必须完全干燥。
六、实验结论使用本发明方法的上述染色步骤，可以看到真的纯冬虫夏草粉中有无混加一些其他物质比如淀粉、植物组织；未被真菌感染的虫体；市售的人工培育的菌丝体等。在进行是否纯冬虫夏草超微粉的判断时，如检测人员经验不足，无法直接判断，则可以用冬虫夏草组织的切片或纯冬虫夏草超微粉制作的涂片为参照判断的标准。冬虫夏草组织的切片，通过4X、10X、40X倍物镜下观察，可见相应染色剂颜色的斑点。通过100X油镜下观察细微结构，除碘液染色片外，对于其余染色液，尤其经过伊红染液、苏木精染液及固绿染液，在冬虫夏草标准切片中，清晰可见虫体菌丝体(见图3)，虫体表皮层(见图5)，虫体肌肉组织(见图7)，子座菌丝体(见图9)，子座表皮层(见图11)等结构的片段，未发现不同形态的物质。本实施例中，待测的纯冬虫夏草超微粉能检出以下五个结构中的任意四个就可以判断为真冬虫夏草粉虫体菌丝体(见图3);虫体表皮层(见图5);虫体肌肉组织(见图7);子座菌丝体(见图9);子座表皮层(见图11)。由于检测物质为1500目以下冬虫夏草超微粉末，所以在100X物镜下观察。检测结果表明市售的极草牌纯冬虫夏草超微粉涂片中，均清晰可见虫体菌丝体 (见图4)，虫体表皮层(见图6)，虫体肌肉组织(见图8)，子座菌丝体(见图10)，子座表皮层(见图12)等结构的片段，与自制的冬虫夏草切片和纯冬虫夏草超微粉涂片对照，各结构均为冬虫夏草的特有结构。对比冬虫夏草纵切片图I、横切片图2，未发现不同形态的物质。 且没有观测到没有明显的植物组织和明显的淀粉颗粒，因此可判定为该批次极草牌冬虫夏草超微粉为纯冬虫夏草超微粉。而添加有淀粉的冬虫夏草粉，由于能检测出代表淀粉的蓝色颗粒，直接就可判定为不纯的冬虫夏草粉。
权利要求
1.鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于包括以下步骤取待检冬虫夏草粉，分别染色制成涂片；所述染色为进行番红-固绿染色；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有观测到明显的植物组织或没有碘液染色下的明显蓝色斑点，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉；所述的冬虫夏草的特有结构为冬虫夏草的虫体菌丝体、 冬虫夏草的虫体表皮层、冬虫夏草的虫体肌肉组织、冬虫夏草的子座菌丝体或冬虫夏草的子座表皮层中的至少4种；所述的番红-固绿染色方法为将涂片用50%乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色， 然后依次分别用50%、75%、95%乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用 95 %、95 %、100 %、100 %的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100 %乙醇混合液中5 lOmin， 再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。
2.根据权利要求I所述的鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于包括以下步骤取待检冬虫夏草粉，分别染色制成涂片；所述染色为进行苏木精-伊红-碘液染色和番红-固绿染色；所述的苏木精-伊红-碘液染色方法为滴加苏木染液IOmin染色后水洗5min，然后依次分别用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗，然后滴加伊红染液染色5min，然后滴加碘液染色5min然后依次分别用50%、75%、95%、100%的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯液中5 IOmin以完成染色；所述的番红-固绿染色方法为将涂片用50%乙醇浸泡后滴加番红染液25min染色， 然后依次分别用50%、75%、95%乙醇梯度洗涤，然后滴加固绿染色lmin，然后依次分别用 95 %、95 %、100 %、100 %的乙醇梯度洗涤，后置于二甲苯与100 %乙醇混合液中5 lOmin， 再置于纯二甲苯液中5 IOmin以完成染色。
3.根据权利要求I或2所述的鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于鉴别冬虫夏草的特有结构时，以用同种方式染色的具有冬虫夏草特有结构的标准切片为参考标准。
4.根据权利要求3所述的鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于对每批待检的纯冬虫夏草粉物料取样6份以上分别制成涂片。
5.根据权利要求4所述的鉴别纯冬虫夏草粉的方法，其特征在于对每批待检的纯冬虫6张涂片中的每I张上都要有至少4种特有结构才为真品。
全文摘要
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及一种显微染色鉴别冬虫夏草粉的方法。本发明要解决的是市场流通与销售的纯冬虫夏草粉难于分真伪的技术问题。本发明解决该问题的技术方案是提供一种准确鉴别冬虫夏草粉的方法。该方法包括以下步骤取待检冬虫夏草粉，染色制成涂片；将制成的涂片于显微镜下进行显微观测，如每片均能清晰观察到冬虫夏草的特有结构，且没有碘液染色下的明显蓝色斑点，并且没有观测到明显的植物组织，即可判断为纯冬虫夏草粉，否则为不纯的冬虫夏草粉。本发明方法能清晰辨认细小的饮片粉末和分辨出不属于冬虫夏草的物质，成本低、效率高，不易受各种添加成分的干扰，准确度非常高，在本领域有很好的应用前景。
文档编号G01N21/84GK102589956SQ20121002191
公开日2012年7月18日 申请日期2010年4月21日 优先权日2010年4月21日
发明者张雪峰, 徐丽 申请人:张雪峰