本发明属于合成生物学和生物能源技术领域，具体涉及一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法。以树干毕赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)为宿主，异源表达密码子优化的衣康酸合成途径，过表达细胞质顺乌头酸酶基因aco，获得树干毕赤酵母衣康酸合成菌株，并在发酵培养基中高效发酵木糖生产衣康酸的方法。
背景技术：
衣康酸作为一种重要的c5二羧酸化合物，被美国能源部列为二十一世纪有限发展的12中平台化合物之一，可广泛应用于化工、医药、农业等领域，具有极其广阔的市场和应用价值。衣康酸的生产方法有微生物发酵粉和化学合成法。化学合成法又可分为柠檬酸合成法和顺酐合成法，因柠檬酸合成法生产成本较高，工业上已不再采用，而顺酐法虽然生产成本低、选择性高，但未实现工业化。而生物发酵粉因原料易得，工艺技术成熟等优点成为国内外工业化生产衣康酸的主导方法。现阶段，微生物发酵生产衣康酸的工程菌株主要是土曲霉类aspergillusterreus。然而，由于土曲霉类的复杂生长形态，限制了发酵过程的可控性和工业化规模；同时由于该丝状真菌的特异性重组频率低，基因工程手段在其菌种改造方面仍很困难，这些因素限制了衣康酸产量的进一步提高。近年来，采用合成生物学，使用非曲霉菌生物合成衣康酸的研究得到了广泛发展。利用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌及酵母菌等模式菌株为宿主，异源表达衣康酸合成途径，用葡萄糖或甘油为碳源经发酵后衣康酸产量达到0.17-7.8g/l(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。然而，以木糖等价格更为低廉的原料为碳源，采用合成生物菌株发酵生产衣康酸的研究未见报道。
作为木质纤维素的重要组成部分，木糖在总的单糖中能占到30％，因此高效利用木糖生产目标代谢物是发展生物质经济的关键问题之一。自然中存在能够天然代谢木糖的微生物，如树干毕赤酵母具有宽广的碳源代谢能力，能高效代谢木糖，同时具有耐低ph和高糖等优点。利用树干毕赤酵母发酵木糖产乙醇、富马酸已见报道(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。这些结果为利用该菌株发酵木糖合成衣康酸奠定了理论基础和操作平台。
本发明首次以树干毕赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)为宿主，异源表达经密码子优化的来源于土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因cad，构建衣康酸合成途径，并过表达宿主菌的细胞质顺乌头酸酶基因aco。获得了树干毕赤酵母衣康酸合成菌株，并在发酵培养基中高效发酵木糖生产衣康酸。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法。采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母pichiastipitisfpl-uc7为宿主，异源表达经密码子优化的来自土曲霉的顺乌头酸脱羧酶cad，进一步过表达树干毕赤酵母fpl-uc7细胞质顺乌头酸酶aco，获得了树干毕赤酵母衣康酸合成菌株。本发明构建过表达cad和aco基因的生产衣康酸工程菌株方法，对开发生物质生产衣康酸具有现实意义和指导价值。本发明采用如下技术方案。
本发明的技术方案如下：
一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法；以树干毕赤酵母pichiastipitisfpl-uc7为宿主菌株，异源表达cad基因和过表达aco基因，其构建步骤如下：
(1)密码子优化土曲霉cad基因，并进行全基因合成；
(2)设计树干毕赤酵母定位细胞质的aco基因引物；
(3)以树干毕赤酵母fpl-uc7基因组dna为模板，扩增aco基因片段；
(4)建立连入cad和aco编码基因的过表达载体py26tef-gpd-ia1；
(5)电转化过表达载体py26tef-gpd-ia1到树干毕赤酵母fpl-uc7感受态细胞，对转化菌株进行木糖补料发酵实验。
所述步骤(1)cad基因扩增引物序列
cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切位点)
cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切位点)。
所述步骤(2)aco基因扩增引物序列
aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切位点)
aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切位点)。
所述步骤(4)将全基因合成的cad基因扩增后，用bamhi-ecori双酶切，与同样用bamhi-ecori双酶切的py26tef-gpd质粒连接，获得质粒py26tef-gpd-cad；将质粒py26tef-gpd-cad和aco基因分别用noti-sacii双酶切，连接后即获得过表达质粒py26tef-gpd-ia1。
所述步骤(5)将过表达载体质粒扩增提纯后，采用电转化方法转入宿主菌株，通过尿嘧啶营养缺陷型固体平板筛选，筛选获得发酵木糖生产衣康酸的树干毕赤酵母合成菌株，然后对该合成菌株进行发酵试验，检测衣康酸产量。
所述木糖补料发酵条件为：1.5vvm通气量、100-400rpm保证溶氧量不低于10％，ph恒定维持6.5，发酵72h补加60ml的无菌500g/l木糖溶液。
所述发酵培养基组成为：木糖20-40g/l，无氨基酵母氮源(ynb)1-2g/l，尿素1-3g/l。
本发明的树干毕赤酵母pichiastipitisfpl-uc7为荷兰微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶营养缺陷型衍生菌株。
发酵木糖生产衣康酸工程菌株构建步骤详细说明如下：
(1)根据ncbi报道的土曲霉cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，设计pcr扩增引物cad-f/r，cad基因序列经密码子优化后进行全基因合成；
(2)根据ncbi报道的树干毕赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在线工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)预测线粒体定位序列，并设计定位细胞质的pcr扩增引物aco-f/r；
(3)以树干毕赤酵母fpl-uc7基因组dna为模板，扩增定位于细胞质的aco基因片段；
(4)建立连入cad和aco编码基因的过表达载体py26tef-gpd-ia1，热激转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进行pcr和双酶切验证，并进行重组质粒py26tef-gpd-ia1的扩增提取；
(5)电转化过表达载体py26tef-gpd-ia1到树干毕赤酵母fpl-uc7感受态细胞，在尿嘧啶营养缺陷型固体平板上(转化子筛选培养基)筛选阳性转化子，进行pcr和双酶切验证，对验证正确的转化子进行3l发酵罐补料发酵试验，检测衣康酸的产量。
pcr引物序列为：
(1)cad基因扩增引物序列
cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切位点)
cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切位点)
(2)aco基因扩增引物序列
aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切位点)
aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切位点)
将全基因合成的cad基因扩增后，用bamhi-ecori双酶切，与同样用bamhi-ecori双酶切的py26tef-gpd质粒连接，获得质粒py26tef-gpd-cad；将质粒py26tef-gpd-cad和aco基因分别用noti-sacii双酶切，连接后即获得过表达质粒py26tef-gpd-ia1，重组质粒py26tef-gpd-ia1构建图谱见附图。将过表达载体质粒扩增提纯后，采用电转化方法转入宿主菌株，通过尿嘧啶营养缺陷型固体平板(转化子筛选培养基)筛选，筛选获得发酵木糖生产衣康酸的树干毕赤酵母合成菌株，然后对该合成菌株进行发酵试验，检测衣康酸产量。
本发明利用合成生物学手段在树干毕赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7实现衣康酸合成途径及优化，成功构建了发酵木糖生产衣康酸的工程菌株。采用本发明基因工程菌进行衣康酸3l发酵罐补料发酵实验，衣康酸合成产量达到了1.52g/l。本发明构建的树干毕赤酵母合成菌株在利用合成生物学高效发酵生物质生产衣康酸中发挥重大的作用，具有重大的潜力和广阔的应用价值。
附图说明
图1：构建重组质粒py26tef-gpd-ia1图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质有权利要求来限定。
本发明利用合成生物学的研究手段，以树干毕赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7为宿主，异源表达衣康酸合成途径：来自土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因cad，优化顺乌头酸酶基因aco，构建cad和aco双基因的过表达载体py26tef-gpd-ia1，将其电转化转入宿主菌株，并对转化子进行分批补料发酵木糖生产衣康酸实验。
材料：
1.树干毕赤酵母pichiastipitisfpl-uc7(荷兰微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶营养缺陷型衍生菌株)
2.taqdna聚合酶(天根生化科技有限公司，中国北京)。
3.t4连接酶以及bamhi、ecori、noti、sacii等限制性内切酶(fermentas公司产品，中国上海)。
4.质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
5.dna纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
6.dna凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)。
7.氨苄青霉素、尿嘧啶(sigma公司)。
8.lb液体培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10。
9.lb固体培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
10.转化子筛选培养基(g/l)：葡萄糖20，无氨基酵母氮源(ynb)13，琼脂粉20。
11.种子培养基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
12.发酵培养基(g/l)：木糖20-40，无氨基酵母氮源(ynb)1-2，尿素1-3，ph6.5。
实施例一：双基因表达载体py26tef-gpd-ia1的构建及转化子获得
(1)根据ncbi报道的土曲霉cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，设计pcr扩增引物cad-f/r，cad基因序列经密码子优化后进行全基因合成。以全合成基因cad为模板，设计引物cad-f/r进行pcr扩增(cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切)，cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切))。将cad基因扩增片段纯化、酶切、回收后，与相应酶切的py26tef-gpd质粒连接，转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性转化子，提取质粒，采用限制性内切酶bamhi和ecori进行双酶切验证，双酶切后经琼脂糖凝胶电泳获得1.5kb左右的酶切片段，命名为py26tef-gpd-cad，对转化子cad基因进行测序，序列为seqno.1。
(2)根据ncbi报道的树干毕赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在线工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)预测线粒体定位序列，设计定位细胞质的pcr扩增引物aco-f/r，aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切)，aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切)。
(3)以树干毕赤酵母fpl-uc7提取的基因组为模板，以aco-f/r为引物pcr扩增定位细胞质的aco基因片段，将所得的pcr产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为分别为2.5kb左右的aco基因电泳条带。
(4)将aco基因扩增片段纯化、酶切、回收后，与相应酶切的py26tef-gpd-cad质粒连接，转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性转化子，提取质粒，采用限制性内切酶noti和sacii进行双酶切验证，双酶切后经琼脂糖凝胶电泳获得2.5kb左右的酶切片段，对转化子aco基因进行测序，序列为seqno.2，实验表明获得了插入序列正确的重组质粒，命名为py26tef-gpd-ia1。
双酶切体系：dna片段15μl，bamhi/noti1μl，ecori/sacii1μl，10×buffer5μl，ddh2o28μl，37℃反应2h。
连接体系：酶切后的目的基因片段12μl，质粒载体片段7.5μl，t4连接酶0.5μl，22℃反应2h。
(5)将树干毕赤酵母fpl-uc7感受态细胞与质粒py26tef-gpd-ia1的混合液(8μl质粒、80μl感受态细胞)转移到预冷的2mm电转杯中，然后用启动电转仪进行转化(转化条件：电压1500v，电容2μf，电阻200ω，电击4-5ms)，电击完毕后立即加入1ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液混匀复苏电击后的感受态细胞，然后转至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴锅孵育2h，5000rpm离心30s，吸去部分上清液剩余约200μl，吹吸重悬，涂布转化子筛选培养基平板，30℃培养3-5天待转化子长出，进行酶切和pcr验证。验证正确后的菌株为能利用木糖发酵衣康酸的树干毕赤酵母合成菌株。
实施例二：树干毕赤酵母合成菌株利用木糖生产衣康酸的分批补料发酵实验(一)
(1)培养基
种子液体培养基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
发酵培养基(g/l)：木糖20，无氨基酵母氮源(ynb)1.0，尿素1.0，ph6.5。
(2)分批补料发酵实验：挑取平板活化的树干毕赤酵母单菌落接种至种子培养基，30℃、200rpm条件下摇瓶培养48小时，离心收集菌体，用新鲜发酵培养基重悬菌体，再以5％接种量接种至发酵培养基中，在3l发酵罐中发酵5-7天。发酵条件：1.5vvm通气量、100-400rpm保证溶氧量不低于10％，ph恒定维持6.5，发酵72h补加60ml的无菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的测定：发酵过程中间隔24h，吸取10ml发酵液，5000rpm离心10min，取上清液进行0.22μl有机滤膜过滤，利用高效液相色谱(hplc)进行样品检测分析。hplc检测条件：色谱柱为aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流动相为15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速为0.8ml/min，柱温为40℃，210nm处紫外检测。测定结果表明：本发明构建获得的树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的产量达到了1.2g/l。
实施例三：树干毕赤酵母合成菌株利用木糖生产衣康酸的分批补料发酵实验(二)
(1)培养基
种子液体培养基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
发酵培养基(g/l)：木糖30，无氨基酵母氮源(ynb)1.5，尿素2.0，ph6.5。
(2)分批补料发酵实验：挑取平板活化的树干毕赤酵母单菌落接种至种子培养基，30℃、200rpm条件下摇瓶培养48小时，离心收集菌体，用新鲜发酵培养基重悬菌体，再以5％接种量接种至发酵培养基中，在3l发酵罐中发酵5-7天。发酵条件：1.5vvm通气量、100-400rpm保证溶氧量不低于10％，ph恒定维持6.5，发酵72h补加60ml的无菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的测定：发酵过程中间隔24h，吸取10ml发酵液，5000rpm离心10min，取上清液进行0.22μl有机滤膜过滤，利用高效液相色谱(hplc)进行样品检测分析。hplc检测条件：色谱柱为aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流动相为15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速为0.8ml/min，柱温为40℃，210nm处紫外检测。测定结果表明：本发明构建获得的树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的产量达到了1.5g/l。
实施例四：树干毕赤酵母合成菌株利用木糖生产衣康酸的分批补料发酵实验(三)
(1)培养基
种子液体培养基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
发酵培养基(g/l)：木糖40，无氨基酵母氮源(ynb)2.0，尿素3.0，ph6.5。
(2)分批补料发酵实验：挑取平板活化的树干毕赤酵母单菌落接种至种子培养基，30℃、200rpm条件下摇瓶培养48小时，离心收集菌体，用新鲜发酵培养基重悬菌体，再以5％接种量接种至发酵培养基中，在3l发酵罐中发酵5-7天。发酵条件：1.5vvm通气量、100-400rpm保证溶氧量不低于10％，ph恒定维持6.5，发酵72h补加60ml的无菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的测定：发酵过程中间隔24h，吸取10ml发酵液，5000rpm离心10min，取上清液进行0.22μl有机滤膜过滤，利用高效液相色谱(hplc)进行样品检测分析。hplc检测条件：色谱柱为aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流动相为15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速为0.8ml/min，柱温为40℃，210nm处紫外检测。测定结果表明：本发明构建获得的树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的产量达到了1.3g/l。
seqno.1
cad
ggatccatgaccaaacaatctgctgactccaacgccaagtccggtgttacctctgagatctgtcactgggcctctaatttggccactgacgacatcccatccgatgtcttggagagagctaagtacttgattttggacggaatcgcctgtgcctgggttggtgccagagtcccatggtctgagaaatacgtccaggccactatgtccttcgaaccaccaggagcttgcagagtcattggttacggtcagaaacttggtccagtcgctgctgctatgaccaactctgcctttatccaggccaccgagttggacgactaccattccgaagccccacttcattctgcctccatcgttttgcctgctgtcttcgctgcctccgaagttttggctgaacaaggtaagactatttccggtatcgacgttattttggccgccatcgtcggttttgagtccggtccaagaatcggtaaggccatctacggttccgacttgttgaacaatggttggcactgtggtgctgtttacggtgctccagctggagctttggccaccggtaagttgttgggtttgactcctgactccatggaagatgccttgggtatcgcttgtacccaagcctgtggtttgatgtctgcccagtacggtggtatggttaagcgtgtccaacacggattcgccgccagaaacggtttgttgggtggattgttggctcatggtggttacgaagccatgaagggtgtcttggagcgttcctacggtggtttcttgaagatgtttaccaagggtaacggacgtgagcctccatacaaggaagaagaggtcgtcgctggattgggttctttctggcacacttttactatcagaatcaaactttacgcttgttgcggattggttcacggaccagttgaggccatcgaaaacttgcagggtcgttaccctgagttgcttaacagagccaacttgtccaacattagacacgtccacgtccagttgtccactgcttccaactcccactgtggttggattcctgaggagagaccaatttcctctattgccggtcagatgtccgtcgcctatatcttggctgttcaattggtcgaccagcagtgcttgttgtctcagttctccgagttcgacgacaacttggagagaccagaggtttgggacttggccagaaaggtcacctcctctcaatccgaggagttcgaccaggatggtaactgcttgtctgctggtcgtgtcagaatcgagttcaacgacggttcctccattaccgagtccgttgagaagcctcttggtgtcaaggagcctatgcctaacgaaagaattttgcacaagtacagaaccttggccggttctgttaccgacgagtctagagtcaaggagatcgaagatttggttttgggtttggacagattgaccgatatttccccacttcttgagttgttgaactgccctgttaagtctccattggttgaattc
seqno.2
aco
ctcagaactgctgtcagagccccacgctctatccgtgggttggccactgctggcttgaccagagactcccaagtgaaccagaacttgttggaatctcactctttcatccaatacaagaagcaactcgagaacctcgacatcgtcaaggccagattgaacagacctttgacttatgccgaaaagcttctctacggtcacttggacgaccctcacggacaagacatccagagaggtgtctcctacttgaagttgagaccagatcgtgtcgcttgtcaagatgccaccgctcaaatggccattttgcaattcatgtctgccggtttgcctcaagttgccactccttccactgtccactgtgaccatttgatccaggcccaaattggtggtgctaaggatttggccagagctattgacttgaacaaggaagtgtacgacttcttgtcgactgcctgtgccaaatacaacttgggtttctggaagcccggttccggtatcatccatcagatcgtattggaaaactacgccttcccaggtgctttgttgatcggtaccgattcgcacactcctaatgctggtggtttgggtcaattggctattggtgtaggtggtgctgatgccgtcgacgtcatggccgacttggcctgggaattgaaggctccaaagatcattggtgtcaagttgaccggtagaatgtccggctggacctcgccaaaggatatcatcttgaagttggctggtatcaccactgtcaagggtggtaccggttccattgttgaatacttcggttctggtgttgaaaccttctcctgtaccggtatgggtaccatctgtaacatgggtgccgaaattggtgctaccacctctgtcttcccattcaacaactccatggttgactatttgaatgccactggtagatccaacattgccgagtttgccaacttgtacaagaaggactacttgtctgccgacgaaggctgtgaatacgaccaagtcattgaaatcgacttgaacaccttggaaccacacattaacggtcctttcaccccagatttggctactccagtctccaagatgaaggaaactgccatcaagaacggctggccattggaagtcaaggttggtttgattggttcttgtaccaactcttcttacgaagatatgaccagagctgcttctattattgaagacgctgccacccatggcttgaagtccaaggctatctacactgtttctcctggttctgaacaagtcagagccaccattgccagagacggtcaattgaagaccttcgaagactttggcggtgttgtcatggccaacgcctgtggtccatgtatcggtcaatgggacagacaagacattaagaagggtgacaagaacaccattgtgtcttctttcaacagaaatttcactgctagaaacgacggtaatccagccactcacgctttcgtcgcttctccagaaatgaccactgctttcgccatctccggtgacttgggtttcaacccaattaccgacaccttgaaggacgctaacggaaacgagttcaagttgaaggaaccagttggtgttggtttaccagttaacggctacgaccctggtgaaaacacctaccaagctccacctgaagacagatcaacagtccaagtgcaaattgccccaacctccgacagattacaaaagttgactcctttcaagccatgggacggtaaggatgccgaaagattaccaatcttaatcaaggccgttggtaagaccacaaccgatcatatttctatggccggtccatggttgaagtaccgtggtcacttggaaaacatctccaacaactacatgattggtgctatcaacgctgaaaacggtgaagccaacaacgtcaagaaccactacactggtgtatactctggtgttccagacactggtgctgcttacagagatgctggccacaagtgggttgttattggtgacgaaaacttcggtgaaggttcttccagagaacacgctgccttggaaccaagattcttgggtggtttcgctatcatcaccaagtccttcgctcgtattcacgaaaccaacttgaagaagcaaggtttgttaccattgaacttcactgacgttgctgcctacgacaaaatccaaccagaagacgaagtagacttgctcggtttgactgaattggcccctggcaagaacgttattctcagagtccacccagctgacggttctgccacctgggaaaccgaattgtctcacacttacaacattgaacaaattgaatggttcaagtacggttccgctttgaacaagatggctgccgttgctgctgaaaagaagtaagtgatgtcttgagaggaaatagttaagtatcatttctttttgtttacctattaacattcattcgtatttatttattcattattataatatgtactttgtttaaatgacgagcattgatc