专利名称：用于木糖和己糖发酵的方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及由木糖和己糖生产燃料的发酵方法。相关领域描述乙醇被承认是未来的燃料。对由再生源生产燃料乙醇的兴趣已显著增加。为了使 燃料乙醇生产变成可实践的现实，需要更便宜的底物和更有效的生产工艺[1，2]。包括所有 植物和植物衍生材料的生物质形成糖的潜在再生源，所述糖可以发酵以生产燃料乙醇和各 种其他燃料和化学物质。除了与再生能量共同的许多利益外，生物质是特别吸引人的，因为 它目前是用于液体运输用燃料的唯一可再生可持续的能源。木质纤维素生物量是吸引人的能量原料，因为它是可以转化成液体运输用燃料的 丰富、自制、再生源(From Biomass to Biofuels :ARoadmap to the Energy Future ；Off ice of Science, US Dept. ofEnergy, December 2005)。木质纤维素生物量由3个主要组分组成纤维素(⑴40-50 % )、半纤维素 (⑴25-35% )和木质素(⑴15-20% ) [3]。在这些中，纤维素和半纤维素构成可以水解为 糖的多糖，所述糖可以发酵为乙醇。在生物量中，大多数纤维素是葡萄糖的结晶聚合物，其 相对难以水解成其单体糖残基。半纤维素是围绕纤维素小纤维的某些己糖和戊糖的短分支 聚合物，其组织化更低[4]。戊糖主要由木糖、并且在较少程度上由阿拉伯糖组成，而己糖通 常是半乳糖和甘露糖。由于其相对开放的结构，半纤维素部分比纤维素部分更易于通过各 种预处理技术转化成其糖单体。为了使木质纤维素生物量至生物乙醇的转化在经济上更可行，半纤维素衍生的单 体糖连同由纤维素衍生的葡萄糖一起变得可发酵是必须的。不幸的是，已知天然(或野生 型)微生物无法使葡萄糖和木糖二者有效发酵为乙醇。野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株可以容易地使生物量的葡萄糖以及其他糖组分如甘露糖、果糖和半乳糖 发酵[5]。形成半纤维素的主要部分的木糖无法由相同的天然酵母菌株发酵。已知几种非 酵母菌属(Saccharomyces)酵母菌株例如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和休哈塔假丝 酵母(Candidashehatae)比其他酵母更有效地使戊糖发酵[6]。在此类酵母中，木糖代谢途 径从木糖到木糖醇再到木酮糖[7，8]。在其他酵母菌株以及细菌和真菌中，木糖也可以经由 单一酶木糖异构酶(XI)转化成木酮糖。无法使木糖发酵的几种酵母(包括酿酒酵母)能 够使木酮糖(木糖的酮糖异构体)[9-12]发酵为乙醇。相当大的努力已集中于微生物的遗 传修饰，以使得木糖和葡萄糖可以使用相同生物体进行有效代谢[13-25]。尽管遗传修饰的生物体(GMOs)具有戊糖和己糖发酵的潜力，但它们的遗传稳定性、乙醇总体得率和在工业发酵条件下存活的能力未得到证明[26，27]。因此，木糖发酵为 乙醇的备选方法涉及使用天然酵母菌株伴随添加用于木糖异构化的外源酶。在这种方法 中，木酮糖的产生使用固定化的葡萄糖/木糖异构酶来完成[11，28-30]。这种方法的要求 是XI连同淀粉酶和蛋白酶是最广泛和廉价的可用商业酶[31]。来自木质纤维素生物量的 水解物将包含木糖和葡萄糖。XI对于木糖的亲和力比其对于葡萄糖的亲和力一般大1至2 个数量级；因此，木糖至木酮糖的异构化将超过葡萄糖至果糖的异构化[31]。然而，所形成 的任何果糖可通过酵母菌属容易地发酵而生产乙醇，因此果糖形成无需担忧。尽管XI能够使木糖转化成木酮糖，但在其中XI具有显著活性的条件下，木糖木 酮糖的平衡比一般很高(大约5 1) [32-34]。因此，木糖异构化不具有有利的正向平衡。 增加木糖转化的一种方法是通过去除产物木酮糖而驱动异构化进行下去。其中木糖的异构 化和木酮糖发酵为乙醇在相同容器中同时发生的同时异构化和发酵(SIF)是用于增加木 糖利用的一种方法。然而，由于XI有活性的PH范围之故，SIF的确具有固有局限性。所有 商购可得的XI在PH 7至8下具有最佳活性，并且XI活性随着pH降低而急剧下降。相比 之下，用于发酵的最佳pH是4至5。与这2个步骤相关的大pH差异对有效执行SIF造成问 题。SIF可以在pH4至7的折衷pH下执行，但结果是两种反应都达不到最佳[11]。在文献 中也提及了尽力分离在显著更低的PH下具有最佳活性的XI用于SIF[30]。然而，看起来这 种酶不具有如由商购可得酶显示的相同活性水平。本发明提供了超过共同发明人之一在Fournier等人美国专利号5，254，468和 Fournier等人美国专利号5，397，700中公开的先前发明之一的进一步改善，所述美国专利 的公开内容各自通过引用整体合并入本文。考虑到上述担忧，显而易见的是本领域仍需要开发使木糖和己糖的有效发酵成为 可能的工艺的方法。发明概述在第一个广泛方面，提供了使一种或多种糖包括木糖发酵的方法，其包括使颗粒 分散到包含硼酸根来源和木糖的混合物中，所述颗粒包括一种或多种共固定酶，并且使混 合物发酵。预计还可使用包含具有第一酶促活性的内核和具有第二酶促活性的外部区域的 双层颗粒。在本发明的一个实施方案中，预计双层颗粒包含木糖异构酶(XI)和尿素酶。在本发明的一个实施方案中，提供了改良发酵工艺的方法，其包括下述步骤，或备 选地由下述步骤组成或基本上由下述步骤组成i)将一种或多种共固定酶颗粒分散到包 含硼酸盐(根)添加剂和木糖的混合物内，所述共固定颗粒具有包括尿素酶的外层和包括 共固定的木糖异构酶(XI)(或两种酶)的内核；ii)使木糖从混合物扩散到其中XI活跃并 且形成木酮糖的内核；iii)使离子形式的至少一定量的硼从硼酸根添加剂扩散到至少某 些颗粒的内核内；iV)使离子化的硼酸根与木酮糖反应，以形成离子化的硼酸根-木酮糖复 合物；ν)使离子化的硼酸根-木酮糖复合物迁移到混合物中；和(vi)使混合物中的离子化 的硼酸根_木酮糖复合物解离以获得游离木酮糖。应当理解，这个工艺的某些步骤可能被 动发生并且不需要肯定性步骤。在某些实施方案中，混合物具有酸性pH，并且至少部分沉淀具有不同pH。此外，在 某些实施方案中，至少部分沉淀的PH是约7至约8，并且混合物的pH是约4至5. 5。在某些实施方案中，混合物具有酸性pH，并且团块的内核具有不同pH。在某些实施方案中，内核的PH是约7至约8，并且混合物的pH是约4至约5. 5。在某些实施方案中，硼酸盐(根)添加剂包括四硼酸钠或由四硼酸钠组成。在某些实施方案中，离子化的硼酸根包括四羟基硼酸根离子或由四羟基硼酸根离 子组成。在另一个广泛方面，提供了使一种或多种糖包括木糖发酵的方法，其包括使双层 团块分散到包含尿素、硼酸根来源和底物的混合物中，其中所述双层团块包含包括固定的 尿素酶的多孔外部区域和包括除尿素酶外的作用于底物的固定酶的多孔内核，以及使混合 物发酵。在另一个实施方案中，提供了使用共固定双层团块产生产物的方法，所述共固定 双层团块具有包含固定的尿素酶的多孔材料外层和包含除尿素酶外的作用于底物以产生 产物的固定酶的多孔材料内核，该方法包括下述步骤，或备选地由下述步骤组成或基本上 由下述步骤组成i)将双层团块分散到包含尿素、硼酸根添加剂和底物的混合物内，所述 混合物具有酸性PH ;ii)使尿素酶与扩散到外层内的尿素反应以产生氨，其消耗向内核扩 散的氢离子，以提供PH高于混合物的酸性pH的内核；iii)当底物扩散到内核内时，使内核 中的固定酶与底物反应，以产生产物；iv)使离子化的硼酸根与产物反应，以产生离子化的 硼酸根-产物复合物；和ν)使离子化的硼酸根-产物复合物移动到混合物，在其中它解离 以释放游离木酮糖。应当理解，这种方法的某些步骤可以被动发生，并且不需要肯定步骤。在这种方法的一个实施方案中，内核中的固定酶是木糖异构酶，并且产物是木酮 糖。在另一个广泛方面，提供了用于将木糖同时异构化和发酵(SIF)成乙醇的方法， 其包括下述步骤，或备选地由下述步骤组成或基本上由下述步骤组成i)使木糖异构酶固 定在多孔聚合物材料中，以便形成基本上球状的颗粒，所述颗粒形成更大团块的内核区域； ii)使颗粒与至少水、尿素酶、单体、交联剂和聚合起始剂相混合，以便形成水性介质，其中 所述水介质和颗粒包括水性悬浮液；iii)使水性悬浮液维持在约0°c至约4°C ；iv)将至 少甲苯、氯仿和表面活性剂加入悬浮液中，以便形成含水疏水相；ν)在氮条件和约0°C至约 4°C下使疏水相搅拌，以允许单体聚合且形成围绕颗粒包含固定在其中的尿素酶的薄聚合 物包被，从而形成双层固定酶团块；vi)使至少木糖原料、尿素和具有高乙醇生产率与乙醇 耐受性的酵母细胞相混合，以便形成总体液体，将所述总体液体放置到具有搅拌工具的封 闭反应器中，vii)设定且调整总体液体的PH，以便使pH维持在约4. 0至约5. 5, viii)使双 层固定酶团块分散到总体液体中；ix)将硼酸盐(根)添加剂加入总体溶液中；χ)使木糖扩 散到团块的内核区域内；xi)通过与固定在内核中的木糖异构酶接触，使扩散的木糖异构 化为木酮糖；xii)使木酮糖向外扩散到总体液体内；xiii)通过使尿素扩散到团块的外层 内，在内核区域中提供约7. 0至约8. 0的pH，由此尿素通过固定的尿素酶水解为氨，所述氨 中和从总体液体扩散到团块的内核区域内的氢或带正电的离子；xiv)在基本上缺氧的条 件和温度下将双层团块和总体液体搅拌足够长的时间段，以便允许木酮糖发酵为乙醇；和， xv)使木酮糖发酵为乙醇，这与木糖至木酮糖的异构化基本上同时发生。应当理解，这种方 法的某些步骤可以被动发生并且不需要肯定步骤。应进一步理解，本文描述的同时异构化和发酵方法采用下述运行i)其中木糖异 构酶和尿素酶共固定在一起的多孔单层颗粒；和ii)具有内层和外层的双层颗粒，其中内层包含木糖异构酶并且外层包含尿素酶。还应当理解，术语“共固定的”在本文中可以指这 两种实施方案。应进一步理解，术语颗粒和团块可以互换使用。在另一个实施方案中，提供了用于木糖至乙醇的同时异构化和发酵的方法，其包 括步骤使木糖、尿素和具有高乙醇生产率与乙醇耐受的酵母细胞在反应器中相混合，以形 成液体混合物，使混合物的PH维持在约4. 0至约5. 5，将具有至少2种酶的共固定酶颗粒分 散到混合物中，将硼酸根来源加入混合物中，使木糖扩散到颗粒内，通过固定的木糖异构酶 的活性，使扩散的木糖异构化为木酮糖，使木酮糖向外扩散到混合物内，通过使尿素扩散到 颗粒内，由此尿素通过固定的尿素酶水解为氨，所述氨中和扩散到团块内的氢离子，从而使 颗粒中的液体的PH在异构化过程中维持在约7. 0至约8. 0，在基本上缺氧的条件下搅拌混 合物以便允许木酮糖发酵为乙醇，以及使木酮糖发酵为乙醇。进一步考虑了包含具有第一种酶促活性的内核和具有第二种酶促活性的外部区 域的双层颗粒的使用。在本发明的一个实施方案中，考虑双层颗粒包含木糖异构酶(XI)和 尿素酶。在另一个实施方案中，发酵在封闭反应器(或发酵罐)中伴随搅拌进行。在某些实施方案中，颗粒可以具有聚合物包被。此类包被的一个非限制性例子是 聚丙烯酰胺。在某些实施方案中，硼酸盐(根)添加剂包含四硼酸钠或备选地由四硼酸钠组成。在某些实施方案中，该方法包括下述中的一个或多个步骤ixa)使硼酸盐(根)添 加剂反应以产生含硼的酸；步骤Xa)使含硼的酸扩散到团块内，并且使木酮糖与该含硼的酸 反应，以产生木酮糖和硼酸根离子的复合物；和步骤Xiia)使木酮糖和硼酸根离子化合物扩 散到总体液体内。在某些实施方案中，该含硼的酸包括硼酸或备选地由硼酸组成。在某些实施方案 中，硼酸根离子包括四羟基硼酸根离子或备选地由四羟基硼酸根离子组成。进一步考虑的是包含木糖、硼酸根来源和尿素的反应介质。在本发明的另一个实施方案中，本文描述的方法提供了使用天然酿酒酵母由木糖 异构化高得率生成木酮糖以及木酮糖和葡萄糖以高百分比转化成乙醇。本发明提供了用于增强木糖至木酮糖的转化，增加乙醇生产速率，以及减少C6和 C5糖发酵所需总体时间的发酵方法。在另外一个实施方案中，提供了在包含双pH环境系统的共固定酶团块系统中由 硼酸盐(根)增强的木糖异构化。在某些实施方案中，该系统包括加入硼砂(四硼酸钠)。 在某些实施方案中，双PH环境系统包括木糖木酮糖平衡中的正向偏移的诱导，这起因于 木酮糖与由硼砂形成的四羟基硼酸根离子的选择性复合。在某些实施方案中，该系统包括 能够在单个容器中维持2种不同pH微环境的基本上同时的异构化和发酵(SIF)步骤，其中 第一种pH对于木糖异构化基本上最佳，并且第二种PH对于木酮糖发酵基本上最佳。在某 些实施方案中，SIF步骤包括尿素酶与木糖异构酶的共固定。在另一个广泛方面，本文提供了涉及共固定酶团块的填充床的新配置，所述填充 床以串联形式与多孔中空纤维膜发酵罐(hollow fibermembrane fermentor, HFMF)连接。 填充床配置提供了不含酵母并且可以容易浓缩用于乙醇回收的发酵醪(beer)。此外，在乙 醇已从发酵醪中蒸馏出后，包含缓冲液和硼酸盐(根)的剩余水溶液可以再循环至上游工艺设备(即水解/异构化)，导致消耗品中的显著成本节省。填充床配置还提供用于异构 化催化剂团块的回收和再利用的简便方法，因为团块局限在填充床内并且不与酵母直接接 触。填充床配置允许木酮糖发酵所需的HFMF中酵母高密度并且还允许酵母用于发酵的延 伸使用。与传统发酵罐不同，酵母在每批发酵后不弃去。填充床配置的模块性质使得SIF 工艺可以容易地按规模扩大，而无需显著的资本成本。根据下述一个或多个优选实施方案和实施例的详述，并参考附图，本发明的各个 目的和优点对于本领域技术人员将变得进一步显而易见。附图简述
图1 固定化XI例如Sweetzyme 团块的横截面，其中显示当尿素酶共固定在团块 中并且将尿素加入发酵液中时所形成的稳态PH谱。发酵液中的pH是PHtl，这一般在4至5 的范围。团块的区带1(外层)包含固定的尿素酶，并且代表当通过尿素的消耗产生氨时， 其中PH随着放射状位置改变的团块区域。区带2 (核心)代表其在PH2 (升高的pH)下的 团块区域。区带1和2之间的边界代表其中所有尿素被消耗的点或尿素酶进入团块内的穿 透深度。图2 曲线图显示经由尿素水解在共固定酶系统中形成2种pH微环境。实心标志 用于表示未经改变的Sweetzyme ；空心标志用于表示XI/尿素酶共固定酶团块。所显示的 3种实验是(A)pH 7. 5 ； (B)具有0.0IM尿素的pH 4. 5，和(C)不含尿素的pH 4. 5 ；每种各 使用0. 13g团块。未经改变的Sweetzyme 在pH 4.5下无木酮糖产生(数据未显示)。B 中显示的木酮糖生成说明，当加入尿素时，XI具有活性。起始木糖浓度为60g/l。图3 曲线图显示对于未经改变的和共固定的酶团块而言，硼酸根有利地使木糖/ 木酮糖平衡偏移。实心标志用于表示未经改变的Sweetzyme ；空心标志用于表示XI/尿素 酶共固定酶团块。所显示的3种实验是(A)pH 7. 5 ； (B)具有0.01M尿素的pH 4. 5，和(C) 不含尿素的PH 4.5。所有3种实验都显示平衡朝向木酮糖生成的显著偏移。仅由曲线B代 表的条件有助于同时异构化和发酵。起始木糖浓度为60g/l。图4 示意性举例说明显示木酮糖-硼酸根复合在共固定酶系统中的作用。当四 硼酸钠(硼砂)加入溶液中时，它解离成四羟基硼酸根(硼酸根，B)离子和硼酸。在团块 内部中，更高的PH有利于更紧密的木酮糖-硼酸根结合(Xu-B复合物形成)，这有效减少了 内部的木酮糖浓度并且迫使异构化正向进行。在总体体积中，较低的PH对Xu-B复合物具 有解偶联效果，使得解离的木酮糖更易于由酵母获得。木酮糖经由发酵去除进一步迫使木 酮糖-硼酸根复合物解离。虚线代表种类的转运；实线代表反应。图5 曲线图显示XI/尿素酶活性对关于共固定酶团块的异构化动力学和木糖/ 木酮糖生产的影响。所有团块都来自相同的共固定批次，并且在PH 7. 5下具有相同的尿素 酶和XI活性/g团块。在所有实验中使用的起始尿素浓度为0.01M。木酮糖得率伴随酶载 量增加而提高可以归于四羟基硼酸根离子在共固定酶团块系统中的双重作用。起始木糖浓 度为60g/l。图6 曲线图显示起始尿素浓度对关于共固定酶团块的异构化动力学和木酮糖生 产的影响。2种实验都使用来自同一共固定批次的0.13g团块，它们在pH 7. 5下具有相同 的尿素酶和XI活性/g团块。在曲线A中可见的异构化和木酮糖生产速率的下降是由于尿 素的消耗。在曲线B中，尿素浓度足够高，能够使得在整个48小时期间木酮糖异构化速率看起来不受尿素消耗影响。起始木糖浓度为60g/l。图7 曲线图显示起始尿素浓度和团块质量对关于共固定酶团块的木酮糖生产的 影响。白色柱是木糖；阴影柱是木酮糖。所有团块(A-E)都来自相同的共固定批次，并且具 有相同的尿素酶和XI活性/g团块；起始PH是4. 5。关于未经改变的Sweetzyme 的结果 在F中给出。所有实验都在25ml培养液中包含0.05M硼酸盐。对于每种实验，总木酮糖百 分比在柱上给出。表观平衡时间和所使用的团块质量在χ轴上显示。图8 曲线图显示金属离子的加入导致异构化朝向木酮糖的小偏移，但该效应不 象加入四硼酸钠有关的偏移那么明显。当加入时，四硼酸钠是0. 05M，并且金属离子是20mM MgCl2和ImM CoCl20所显示的所有数据是关于在pH 7. 5下的未经改变的Sweetzyme 。所 显示的4次实验不同之处在于添加剂，分别是(A)无添加剂；(B)金属离子；(C)硼酸根；和 (D)硼酸根和金属离子。图9 流程图显示用于同时异构化和发酵“SIF”过程的填充床和发酵罐模块配置。 中空纤维膜发酵罐(HFMF)显示微孔纤维和酵母细胞的放大图(blow-up)。糖流动经过纤维 腔，并且酵母在围绕纤维的空间内生长。糖经过纤维壁中的孔扩散到酵母，其中糖被发酵为 乙醇。乙醇向回扩散经过孔进入纤维腔内，并且在结束时流动到装置外。酵母细胞被限制 在外壳空间，并且如所示的可以以极高密度/单位体积装载。图10 关于填充床和摇瓶中的共固定酶团块的异构化动力学。所有团块都来自相 同的共固定批次，并且在PH 7. 5下具有相同的尿素酶和XI活性/g团块。在所有实验中使 用的起始尿素浓度为0. 05M。与在搅拌摇瓶中的对照实验相比较，异构化动力学对于填充床 实验而言明显更快。图11 关于HFMF中的葡萄糖发酵的结果。起始葡萄糖浓度为60g/l。将25g酵母 细胞填充到HFMF的毛细管外空间。发酵使用不同介质流速进行24小时。乙醇生产速率在 30-50ml/分钟的流动时达到峰值，具有接近100%的乙醇得率。理论乙醇得率为0. 51g乙
醇/g葡萄糖。图12 浸没到发酵罐中的转篮(basket)催化团块限制室。图13 使用共固定酶技术的工艺配置的例子。工艺A-在pH 4.8和50°C下在硼 酸盐(根)和尿素的存在下，使用共固定酶团块与纤维素酶可以使同时糖化和木糖异构化 (SSI)成为可能。所得到的葡萄糖和木酮糖的糖混合物可以通过天然酵母发酵。工艺B-在 PH 4.5和351下在硼酸盐(根)和尿素的存在下，共固定酶团块和天然酵母加入生物量水 解物能够进行同时异构化和发酵(simultaneousisomerization and fermentation, SIF), 接近所有生物量糖的理论乙醇得率。工艺C-使用天然酵母的C6和C5糖的同时糖化和发 酵(SSIF)可以用共固定酶团块在维持在pH 4. 8和35°C下的介质中来完成，所述介质中包 含硼酸盐(根)、尿素、纤维素酶和天然酵母。优选实施方案详述定义应当理解，本发明并不限于所述具体方法、方案、细胞系、类和试剂，因为这些可以 改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意欲限制本发 明的范围。如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“a”、“and”和“the”包括复数的指示物。除非另有明确说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 普通技术人员通常理解相同的含义。在从木质纤维素中回收的糖中，D-葡萄糖可以通过面包酵母或啤酒酵母(酿酒酵 母)容易地转化成乙醇。然而，通过半纤维素部分水解获得的木糖不能由此相同酵母种类 发酵。通过天然酵母的木糖发酵可以经由木糖至其酮糖异构体即木酮糖的异构化来达到。 用外源木糖异构酶(XI)的异构化在PH 7-8下最佳发生，而木酮糖至乙醇的后续发酵在PH 4-5下发生。本申请整篇描述了用于实现异构化和发酵的方法，包括先前在发明概述中阐述的 那些方法和工艺。在第一个广泛方面，提供了通过使用固定化酶系统将木糖有效异构化成木酮糖的 方法，所述固定化酶系统能够在单个容器中维持2种不同pH微环境，该系统还提供适合于 发酵的条件。甚至在该固定化酶团块悬浮于其pH对于XI活性而言亚最佳的总体液体中时，本 文描述的方法的双酶团块测试也显示木糖至木酮糖的转化。共固定化酶团块可以用于有效 执行木糖的“同时异构化和发酵”(SIF)。在一个具体实施方案中，为了帮助平衡向有利于木酮糖形成进一步偏移，将四硼 酸钠(硼砂)加入异构化溶液中。四羟基硼酸根离子与木酮糖的结合有效减少了木酮糖的 浓度，并且导致木糖异构化增加。在另一个具体实施方案中，向包含此类共固定化酶团块的异构化溶液中加入 0. 05M硼砂，导致在对于XI活性为亚最佳的pH下有高达86%的木糖至木酮糖转化。这样， 本文描述的方法适合于工业条件，并且可以显著提高在SIF方法中由木糖生成乙醇的得率。为了克服用于异构化和发酵的最佳pH的差异，现在描述了一种引入与木糖异构 酶共固定的尿素酶的新异构化方法。这种方法使用包括固定在多孔团块中用于异构化的XI 和用于PH控制的共固定化尿素酶的共固定化酶团块(图1)。当共固定化酶团块分散在除用于发酵的其他必需成分外还包含尿素的发酵液中 时，有可能维持在团块的总体液体和核心区域之间的显著PH梯度，因为随着氢离子扩散到 团块内，它们被尿素酶水解尿素产生的氨中和。维持在团块内核中的较高PH下的XI随后 催化木糖至木酮糖的异构化；木酮糖从团块中扩散，并且随后可供总体溶液中的发酵利用。优选地，在发酵液中使用的尿素浓度为约0. OlM尿素至约0. IM尿素。在本发明的 一个特别优选的实施方案中，尿素浓度为约0. IM尿素。尽管共固定化酶方法能够维持SIF中的异构化和发酵步骤之间的必需pH差异，但 SIF中的乙醇总体生产速率可能受可供酵母利用的木酮糖总浓度限制。在正常平衡条件下， 木酮糖浓度通常充其量为木糖浓度的五分之一。因此，需要使平衡朝向更高木酮糖形成偏 移的方法，这将进一步增加乙醇生产率。该方法进一步包括在发酵液中使用硼酸盐(根)添加剂，其提供木糖木酮糖平 衡朝向木酮糖形成增加偏移。在本发明的一个实施方案中，硼酸盐(根)添加剂是四硼酸 钠。在本发明的非限制性假设中，认为硼酸根离子可以使XI催化的异构化中木糖和木酮糖 之间的平衡从约20 80偏移成约70 30。据信硼酸根离子与木酮糖的结合比木糖更紧密，有效减少产物浓度，并且因此使平衡朝向木酮糖形成增加偏移。硼酸根与木酮糖结合的 这种能力是PH依赖性的，其中较高的pH(6至7.5)有利于更紧密的结合。因此，随着pH增 加，游离木酮糖的浓度下降。因此，硼酸根存在下木酮糖的发酵速率也是PH依赖性的，其中 较低的PH导致较高的游离木酮糖浓度，进而较高的乙醇生产产率和速率。
在提供用于异构化和发酵的不同微环境的某些共固定化酶方法中，微环境可以通 过向发酵液中加入硼酸盐(根)而获益。在共固定酶团块内，PH是升高的，XI有活性，并 且异构化平衡因与木酮糖的强硼酸根结合而得到促进。相比之下，在低PH发酵液中，硼酸 根对于木酮糖具有减少的结合亲和力，并且因此产生更高的游离木酮糖浓度用于发酵为乙本文描述的共固定酶方法对于与常见酿酒酵母发酵最佳的条件结合的异构化特 别有效。本发明有用的由木酮糖和葡萄糖生成乙醇的另一些生产者包括但不限于酒香酵母 属(Brettanomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有抱圆酵母属(Torulaspora)、 酵母菌属、管囊酵母属(Pachysolen)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉逊酵母属 (Hansenula)的物种。本领域众所周知的常规发酵技术可以用于使总体液体中的木酮糖和葡萄糖发酵 为乙醇。如发酵工艺中一般的，较大程度上缺氧的条件和维持在约30°C至40°C的发酵温度 对于执行本文所述的方法和工艺有用，尽管应当理解微需氧的条件也可能是有用的。葡萄糖和木糖可以通过用于木质纤维素水解的常规技术衍生自木质纤维素生物 量。由于其结晶结构和与生物量中的木质素紧密结合，提供葡萄糖原料的纤维素难以水解。 相比之下，半纤维素的无定形结构使得其可以容易地通过弱酸水解成其组成性糖，即木糖 以及阿拉伯糖和葡萄糖。在一个具体实施方案中，介质组成不仅使平衡偏向有利于木酮糖生产，还改善XI 活性。此外，在某些实施方案中，硼酸根和/或其他金属离子可用于调节异构化反应的动力 学和/或平衡。因此，在某些实施方案中，二价金属离子可用于增加XI的长期活性。在本 发明的一个优选实施方案中，二价金属离子选自镁(Mg2+)和钴(Co2+)。这些优点现在将通过下述非限制性例子举例说明。本发明在下述实施例中进一步 描述，其中除非另有说明，所有份和百分比均是重量，并且度是摄氏度。应当理解，这些实施 例指示本发明的一些优选实施方案，仅是用于举例说明。根据上文说明书和这些实施例，本 领域技术人员可以确定本发明的基本特征，而不背离其精神和范围，并且可以对本发明作 各种改变和修饰以使其适应于各种使用和条件。本说明书中提及的所有出版物，包括专利 和非专利文献，通过引用特别合并入本文中。下述实施例意欲举例说明本发明的某些优选 实施方案，并且不应被解释为限制如在权利要求中限定的本发明的范围，除非如此说明。
实施例材料与方法化学制品由鼠链霉菌(Sti^ptomyces murinus)产生的固定化葡萄糖异构 酶Novo Sweetzyme (Sigma Aldrich G4166，彡350U/g，其中活性基于葡萄糖至果糖的 异构化)，和由锈赤链霉菌(Str印tomyces rubiginosus)产生的固定化葡萄糖异构酶 GenencorGenSweet IGI (220U/g，其中活性基于葡萄糖至果糖的异构化)，用于木糖的异构化。固定化的葡萄糖异构酶在PH 7.5-7.8和54-601下对于葡萄糖/果糖异构化具有最 佳活性(根据制造商)。Sweetzyme 或GenSweet 团块是干燥、褐色、柱形颗粒，直径为约 l-3mm。刀豆尿素酶(Sigma U4002，70，400U/g)用于产生在异构化研究中使用的共固定化 酶团块。尿素酶在PH 7.0和25°C下具有最佳活性(根据制造商)。2种酶都贮藏于4°C。 另外的化学制品，包括木糖、尿素、硼砂、氯化镁、氯化钴、柠檬酸钠和Tris，都购自Sigma Aldrich(St. Louis, MO)。尿素酶在Sweetzyme 和GenSweet 团块上的固定对于尿素酶在团块上的共固 定，将500ml lg/1或2g/l尿素酶溶液和2g Sweetzyme团块加入1升烧杯中。将烧杯放置 在工作台上在室温下24或48小时，以形成共固定酶团块。共固定酶团块通过倾析和重力过滤与溶液分开，并且在纸巾上在室温下干燥24 小时或直至干燥。将共固定酶团块贮藏于4°C直至使用。固定化尿素酶的活性在PH 7. 5和 25°C下使用标准测定法操作进行测量，所述标准测定法操作测量氨释放速率。用这种固定 操作获得的尿素酶活性是550-577U/g团块，其中1单位在测定法条件下释放1 μ mol氨/ 分钟。木糖异构化动力学和平衡的测量所有实验在34°C下在25ml体积中在温育摇床 中以130rpm搅拌的50ml摇瓶中进行。每个实验一式两份地进行。所有实验使用60g/l木 糖，并且除非另有说明，每次实验使用5. 2g/l酶团块(0. 13g)。在制备异构化介质中使用 的缓冲溶液是0. OlM Tris缓冲液(使用0. OlM NaOH将pH调整至7. 5)和0. 05M柠檬酸钠 缓冲液(使用柠檬酸将PH调整至4. 5)。在使用共固定化酶团块的实验中，尿素浓度为0、
0. 01 或 0. IMo分析技术和数据分折为了就木糖和木酮糖浓度分析实验，在每个时间点时收集 200 μ 1样品。样品用去离子水1 3稀释，随后通过0.2μπι滤器过滤。以相似方式制备 在PH 4.5柠檬酸缓冲液中浓度范围0. 25至80g/l的木糖和木酮糖校正标准。所有标准 和样品通过HPLC使用30 μ 1注射体积用100 μ 1注射环进行分析。使用的HPLC设备是配 备SIL-IOAi自动进样器和折射指数检测器(RID 10A)的ShimadzuSeries IOA HPLC设备。 Bio-Rad Aminex HPX-87P (300x7. 8mm)离子交换柱用于糖分析，其中使用去离子水的移动 相，流速为0.6ml/分钟，温度为80°C。这个柱在分离木糖和木酮糖方面是成功的。为了测 定木酮糖-硼酸根复合物是否解离且分开洗脱，注射硼酸根和硼酸根与木酮糖的溶液，测 量硼酸根峰面积。因为硼酸根峰的高度不依赖于木酮糖浓度，所以本发明人现在相信木酮 糖-硼酸根复合物解离成了木酮糖和硼酸根，并且木酮糖峰代表混合物中的总木酮糖。最 后，总计在每个时间点上关于木糖和木酮糖浓度的数据，并且标准化至60g/l总浓度，以消 除变异性并弥补质量余额。所有实验一式两份地进行，并且数据是重复性很好的；所显示的 数据代表一次轮操作。结果和讨论共固定化酶团块系统能够在单个容器内实现2种不同pH微环境一 一种对于XI 活性最佳，另一种适合于进行发酵。此外，四硼酸钠十水合物(硼砂)能够改变动力学并且 使木糖/木酮糖平衡偏移。单个容器中的双pH环境的可持续性未经改变的团块作为起始对照实验，以接到的形式(即没有共固定尿素酶)使用Sweetzyme 团块研究木糖至木酮糖的异构化。在25ml溶液中，对60g/l的起始木糖浓 度，采用0. 13g团块在34°C下监控木糖消耗和木酮糖形成的时间进程。异构化混合物在pH 7. 5下缓冲，这是XI活性的最佳pH。如图2曲线A中可见，木酮糖的浓度稳定增加，并且达到约9g/l的平衡值，暗示在 这些条件下接近6 1的平衡木糖木酮糖比。当在更低的pH-pH 4. 5下重复相同实验时， 即使在40小时后，在反应混合物中也未检测出木酮糖(数据未显示)。在pH 4.5下，XI比 其最佳值低3个pH单位，并且基本上不显示活性。XI/尿素酶共固定酶团块共固定化酶团块通过使尿素酶吸附到Sweetzyme 团块 上而形成。将共固定化酶团块(0. 13g)加入包含60g/l木糖缓冲至pH 4. 5的25ml反应介质 中。与未经改变的团块一样，在这些条件下即使在48小时后也未观察到木酮糖形成(参见 图2，曲线C)。接下来，将0. OlM尿素加入缓冲至pH 4. 5的总体溶液中。在尿素的存在下 观察到木酮糖的形成，并且反应介质中的木酮糖浓度逐渐增加，到48小时达到约5g/l的值 (参见图2，曲线B)。由团块中固定的尿素酶催化的尿素水解产生氨会升高团块的核心内的内部pH，如 图1中所示。在某些实施方案中，内部PH必须显著超过总体溶液的pH4. 5，以便使团块内的 XI有催化活性。因此，当总体溶液中的木糖扩散到团块内且达到其中XI有活性的更高PH 区域时，木糖异构化而形成木酮糖。同时，在共固定化酶团块的外层(区带1，图1)中连续 产生氨也趋于中和从总体溶液中扩散到团块的核心内的任何氢离子，从而维持团块的内部 和外部溶液之间的PH差异。因为图2中所示的曲线B中的异构化速率低于在未经改变的团块中在pH 7. 5下 获得的异构化速率，由此显示内部PH未维持在7. 5而是在亚最佳pH，其或高于或低于7. 5。 如果内部PH是亚最佳的，那么XI活性将低于在pH 7. 5下未经改变的团块的活性，并且达 到平衡所需的时间将更长。如果XI活性在共固定化酶团块中减少，那么异构化所需的时间 可能最终耗尽来自总体溶液的尿素，此时XI活性将丧失，并且异构化反应将停止。内部团块pH是团块中的尿素酶载量以及尿素浓度谱的函数。关于尿素的尿素酶 水解的米氏常数(Km)是2. 9mM，因此对于0. OlM(IOmM)尿素而言，尿素最初在团块的表面上 以约78%的Vmax被消耗。增加尿素的总体浓度将导致氨产生增加和内部团块pH的增加。 取决于内部PH是超过还是低于最佳XI活性的pH，内部pH的增加将降低或提高木糖异构化 的速率。为了在共固定化酶团块系统中实现理想异构化，总体溶液中的尿素浓度可以针对 具体尿素酶载量进行最佳化，并且可以在整个异构化过程中维持在恒定浓度下，以获得最 大的恒定XI活性。共固定酶团块中的显著XI活性已在总体pH 4. 5下用0. OlM尿素得到证实。因为 乙醇的总体生产速率受酵母可供利用的木酮糖总浓度限制，所以在某些实施方案中，希望 修饰条件以有利地增强异构化和木糖木酮糖比例。在某些实施方案中，向反应介质中加 入硼酸盐用于增强异构化动力学，并且使平衡有利地偏移。四硼酸钠添加对木糖异构化的影响糖-硼酸根复合的机制由于四羟基硼酸根离子与醛糖和酮糖的结合，硼酸根导致平衡异构化的偏移。在接近中性PH下，四羟基硼酸根离子可以通过硼砂 (Na2B4O5(OH)4 · 8H20)水解形成 B4O, (OH) 42>5H20<—>3B (OH) ,+B (OH)厂+OH-
(1)在上述反应中产生的硼酸是弱酸(pKa⑴9)，其通过在中性pH下与水反应而轻微 离子化，形成另外的四羟基硼酸根离子B (OH) 3+H20<—>B (OH)厂-+H+(2)在上述反应中产生的四羟基硼酸根离子能够与糖分子上的邻近羟基复合。如式3a 和3b中所示，每个四羟基硼酸根离子能够在2步过程中结合高达2个分子的糖。
四羟基硼酸根离子
Θ
HO、/O、
ho>^R
HO^
R
HOn
B .R
O
θ
H,O
(3a)
糖
单复合物
HO^
糖
R
单复合物
A A rVbV
双复合物
θ
H7O
(3b)与木糖的环状半缩醛形式相比较，硼酸根经由上述机制能够与木酮糖的开链结构 更容易地复合。这种结合的偏好性导致木糖木酮糖异构化平衡向有利于木酮糖形成的方 向偏移。未经改变的团块首先，研究了在pH 7. 5的缓冲液中四硼酸钠对于未经改变的XI 团块的异构化动力学和平衡的影响。这些数据显示于图3曲线A中。与在不存在硼酸根的 情况下获得的相应数据(图2曲线A)相比较，甚至在这种低浓度(0.05M)下，硼酸根也能 够使平衡显著向有利于更高木酮糖生产的方向偏移。木酮糖的平衡浓度达到…30g/l，这 比不用硼酸根可见的水平高3倍(…9g/l)。硼酸根添加导致木糖的转化增加以及平衡木 糖木酮糖比从…6 1偏移到…1:1。尿素酶共固定化酶团块尿素酶固定对团块的影响对在PH 7. 5下达到的总体动 力学和平衡的影响微乎其微，如图3曲线A和C所显示的(两者都在不含尿素的情形下运 行)。固定的尿素酶可能增加小质量转移阻力，这可能是随着木糖浓度下降观察到动力学减 慢的原因。接下来，在向柠檬酸缓冲溶液中加入尿素(0.01M)后，用共固定酶团块存在木酮 糖的显著形成，到48小时时木酮糖达到…17g/l的浓度。这个值比不添加硼酸盐(根)达 到的相对应水平(其为约5g/l)高得多(参见图2曲线B和图3曲线B)。再次提及式1和2中给出的反应，四羟基硼酸根离子的形成受介质pH影响。因此， 硼砂使木糖木酮糖异构化平衡偏移的能力也是PH的函数。在低pH(4至5)下，形成极少 的四羟基硼酸根离子(因为未发生第二个反应)，因此硼砂较不可能对异构化平衡具有任 何影响。另一方面，在较高PH范围(6至8)，四羟基硼酸根离子浓度达到显著水平，并且这 些离子与木酮糖强结合(式3)，使异构化平衡偏移。
15
如图4中所示，在双pH环境共固定酶团块系统中，团块的核心区域(其中pH更 高，XI有活性)提供有助于木酮糖与四羟基硼酸根离子的强结合和木酮糖-硼酸根复合物 (Xu-B)形成的条件。然而，在其中pH较低的总体溶液中，发生极少的硼酸根-糖复合物形 成。在SIF情形下，这种双pH环境的可能净结果是硼酸扩增到团块内，转化成四羟基硼酸 根离子(式2)，与木酮糖结合，并且将木酮糖从团块内部运送到外部总体溶液。在低pH总 体溶液中，Xu-B释放木酮糖，并且硼酸根离子与氢离子重组以形成硼酸。因此，四羟基硼酸 根除异构化平衡偏移外，还促进木酮糖从团块的核心去除到总体溶液内，在此木酮糖可以 通过酵母容易地代谢为乙醇。在0. 05M硼酸盐的存在下异构化的木糖给料溶液已用于采用 酵母的发酵研究中，并且未观察到硼酸根对酵母的抑制[45]。共固定酶团块质量对异构化的影响与尿素酶共固定的Sweetzyme 团块的活性依赖于许多因素。这些因素包括总体 溶液中的尿素浓度和PH，以及固定在团块的外层(区带1)中的尿素酶活性。这些因素影响 氨的产生和扩散的氢离子的中和，进而活性XI区带(区带2)的大小。在图5中，瞬时木酮糖生产显示为共固定酶团块总质量的函数。使用的所有团块 都来自相同的共固定批次，并且具有相同的尿素酶和XI载量。实验在34°C和PH 4. 5下用 0. OlM尿素、0. 05M四硼酸钠和60g/l的起始木糖浓度进行。与曲线A(5. 2g/l)相比较，图 5曲线B和C中所示的实验具有多3. 3 (18g/l)和6. 6 (36g/l)倍的每种酶。在所有实验中 的时间零点时，随着氨产生，内部PH快速增加至接近于对于XI活性最佳的值。在实验B和 C中，增加的尿素酶和XI质量将引起总体尿素和木糖浓度比A中更快速的减少。随着总体 尿素浓度减少，每团块的氨产生减少，并且内部PH也开始下降。pH的这种下降在其中尿素 酶总质量(活性)更高的情况下更早发生，导致XI比活性相伴地丧失。根据图5中所示的数据，对于异构化的第一个小时计算平均XI比活性；这些结果 概括于表1中，所述表1显示共固定酶团块质量对异构化动力学和木酮糖生产的影响。总 XI与团块质量成比例，但在第一个小时内测量的XI活性依赖于团块内的内部pH谱。随着 团块质量增加，总体尿素浓度更快速地下降，并且改变的内部PH谱导致XI比活性明显减 少。尽管尿素消耗和XI活性的丧失对于最高团块质量而言最快速发生，但在XI有活性时 所产生的总木酮糖是最多的。
表1实验团块质量第一个小时 内的平均 XI活性第一个小时内的 XI比活性(平均)最终[木酮糖]A0. 13 g7. 8 U58. 5 (U/G 团块)20. 0 g/LB0.45 g20.4 U45. 3 (U/G 团块)34.4 g/LC0. 9 g34. 9 U38. 8 (U/G 团块)44. 0 g/Lu =在34X和总体pH 4. 5下每分钟产生1 μ mol木酮糖 平均XI比活性(基于在pH 4. 5下每克团块的木酮糖生成)随着团块质量增加而 减少。然而，相对应的总XI活性更高，导致到48小时快得多的木酮糖生产和高得多的木酮
糖得率。
最高团块质量在48小时时的木酮糖浓度(…44g/l)实质性地高于用相同硼酸根 浓度用未经改变的团块在PH 7. 5下达到的值(⑴30gl/)(图3曲线A)。对于未经改变的 Sweetzyme 团块，异构化的动力学依赖于XI活性，但平衡仅受热力学控制，并且不受XI活 性和团块质量影响。在共固定酶团转化更高块系统中，木酮糖转化比用未经改变的团块在pH 7. 5下 可能实现的转化更高。如图3和4中所示，在共固定酶团块系统中，四羟基硼酸根通过与木 酮糖结合而使平衡偏移，并且还使复合的木酮糖从团块内部穿梭到总体溶液。尽管不希望 受理论束缚，但本发明人在本文中认为，当建立起PH梯度时，四羟基硼酸根的这种双重作 用与在共固定酶团块系统中可见的木糖转化的显著改善有关。尿素的作用总体介质中的尿素浓度将影响所产生的氨的速率和量，并且因此影响共固定酶团 块内的PH梯度的维持。尿素浓度也将决定活性XI核心的体积，继而这将影响异构化的动 力学和异构化的程度。在图6中，瞬时木酮糖生产显示为尿素浓度的函数。所使用的所有 团块都来自相同的共固定批次，并且具有相同的尿素酶和XI载量。实验在34°C和pH 4.5 下用0. 01M(图6，曲线A)或0. IM尿素(图6，曲线B)、0. 05M四硼酸钠和60g/l的起始木 糖浓度进行。如这2种实验中可见的，木糖异构化的速率对于前4个小时非常相似。对于2种 情况，尿素浓度显著高于尿素酶的Km，因此在团块内的内部pH谱可能是相似的。因为团块 还具有相同的XI载量，所以木酮糖生产在两者中是相当的。然而，到8小时，图6曲线A中 的尿素消耗导致尿素水解的反应速率下降。伴随氨产生的减少，具有活性XI的团块的内部 体积减少，并且在图6曲线B中观察到木酮糖生产下降。基于图6曲线A所示的结果，尿素 水解到24小时不再能有效维持这些双pH微环境。对于图6曲线B，对于高得多的起始尿素 浓度，木糖异构化的活性区带维持长得多的时间段(> 48小时)。在48小时时测量的最终 木酮糖浓度是…52g/l，相当于…1 6.5的木糖木酮糖比。在过量尿素的存在下共固定酶团块质量对异构化的影响团块质量和尿素浓度对异构化溶液的最终组成的影响概括于图7中。团块质量为 0. 13g至0.9g/实验，而起始尿素浓度为0.01或0. 1M。对于0. OlM尿素(图7，B和C)，团 块质量的增加导致木酮糖生产速率的增加(还参见图5)以及所产生的总木酮糖的增加。 然而，用0. OlM尿素的实验无一达到与加入0. IM尿素时用最低团块质量所达到的一样高的 木酮糖得率。对于0. IM尿素(图7，D和E)，团块质量的增加也导致木酮糖生产速率的增 加和达到最终溶液组成所需的时间的减少，但最终木酮糖得率保持不变。尽管增加团块质 量(更多XI)可增加异构化动力学，但尿素在维持XI活性和达到高木酮糖得率中起基本作 用。由于独特的双PH微环境和木酮糖至总体溶液的硼酸根穿梭，共固定化酶系统比用天然 XI在其最佳PH下达到的水平显著更高的木糖至木酮糖的转化(…86% )(图7，F)。金属离子添加对木糖异构化的影响除评估硼酸根使木糖至木酮糖的平衡有利地偏移的功效外，还考虑长时间段维持 XI的持续最佳活性。XI酶需要金属离子用于活性，并且这些离子可以在异构化过程中耗 尽。本发明人测试XI活性的改善是否可以通过将Mg2+和Co2+离子加入介质中来实现。在这些实验中，使用在pH 7. 5下的未经改变的Sweetzyme 。在不存在硼酸根的情况下，金属离子的添加导致异构化朝向木酮糖的小偏移(图8曲线A和B)。在硼酸根的 存在下，观察到异构化的相似偏移(图8曲线C和D)。因此，金属离子单独或与硼酸根组合 可使木酮糖生产的改善增加，但效应不象与四硼酸钠添加相关的偏移那么明显。在某些实 施方案中，补充金属离子可能有助于颗粒的长期活性和再使用性。白杨水解物与异构化团块加入发酵罐中进行SIF当未经过滤的水解物用于发酵时，由于中空纤维的栓塞，无法使用HFMF。在3种不 同发酵中进行SIF，其中发酵液包含(1)纯木糖，(2)等比例的葡萄糖和木糖，和(3)白杨 水解物。在所有实验中都使用的硼酸根不会不利地影响酵母活力或其产生乙醇的能力。在同时异构化和发酵(SIF)实验中，将共固定酶团块加入在标准发酵罐内的发酵 液中，使起始异构化进行24小时，随后将酵母加入以起动发酵。如表2中对于纯木糖所示的，本发明人能够在28小时内发酵至98 %的乙醇理论得 率。为了模拟水解物，本发明人还使包含等量葡萄糖和木糖的糖介质发酵。关于混合糖的 这些结果显示，在SIF模式中，本发明人能够使几乎所有可用的葡萄糖和木糖发酵，并且在 仅36小时内产生88%的乙醇得率。对于白杨水解物，在发酵结束时可见木糖的完全转化， 指示发生了 SIF。 对于经过滤的生物量水解物的同时异构化和发酵(SIF)系统使用图9是用于SIF工艺的共固定酶团块的填充床和发酵罐模块配置的示意性举例说 明。中空纤维膜发酵罐(HFMF)显示微孔纤维和酵母细胞的放大。糖流动经过纤维腔，并且 酵母在围绕纤维的空间中生长。糖经过纤维壁中的孔扩散到酵母，其中糖被发酵为乙醇。乙 醇向回扩散经过孔进入纤维腔内，并且在结束时流动到装置外。酵母细胞被局限于外壳空 间内，并且如所示的可以以极高密度/单位体积装载。这种配置提供了不含酵母并且可以容易浓缩用于乙醇回收的发酵醪。在乙醇已从发酵醪中蒸馏出后，包含缓冲液和硼酸根的剩余水溶液可以再循环至上游工艺设备(即水 解/异构化)，导致消耗品中的显著成本节省。这种配置提供了回收和再利用异构化催化剂 团块的简便方法，因为它们局限于填充床并且不与酵母直接接触。这种配置允许HFMF中木 酮糖发酵所需的酵母高密度以及酵母用于发酵的延伸使用。与传统发酵罐不同，酵母在每 批发酵后不去除。这种配置的模块性质使得SIF工艺可以很容易按规模扩大，而无需显著 的资本成本。用于SIF的模块配置的使用。包含4. 5g尿素酶包被的GenSweet 团块的填充床反应器用于木糖异构化。反应 30cm 胃 * Icm 内 @ 白勺 (KontesChemistry and Life Sciences Products)。 F50NRe Hemof low 中空纤维发酵罐装载有50g干酵母用于糖至乙醇的发酵。包含60g/l葡 萄糖和30g/l木糖的250ml体积营养素缓冲液随后以30ml/分钟的速率循环用于异构化和 发酵。在34°C和pH 4. 5下运行3种不同情况1)在填充床设备中无团块的发酵(无异构 化)；2)糖溶液预异构化1小时随后同时异构化和发酵(SIF)；和3)同时异构化和发酵。这些实验的结果概括于表3中。对于这3种情况，所有葡萄糖均在2小时内转化 成乙醇。
在情况1中，尽管消耗木糖，但由这种糖未产生乙醇，因为乙醇浓度在2-24小时之 间恒定。在不存在木糖异构酶(XI)的情况下，不形成木酮糖；木糖由酵母利用以形成其他 代谢产物例如木糖醇和阿拉伯糖醇。
对于情况2，一半木糖在发酵起始前异构化为木酮糖。到24小时，所有葡萄糖、所 有起始木酮糖和部分起始木糖都已转化成乙醇。XI的存在允许木糖至木酮糖和至乙醇的快 速转化，这减少了木糖向他副产物途径的流量。这些数据指出，额外木糖的异构化和木酮糖 的发酵在24小时期间发生，具有比情况1相应更高的乙醇得率。对于情况3，数据显示木酮糖在产生后快速发酵，因为超过5小时时木酮糖的浓度 为零。然而，乙醇浓度继续增加并且到24小时已达到理论得率的95%。在模块配置中白杨水解物的异构化和发酵这个实施例证实本文描述的系统对于生物量水解物的活力。尽管模型糖溶液包含 水解物中存在的主要糖，但实际水解物可能包含另外的水解产物，其可以抑制发酵和异构 化。为了验证共固定酶团块以及发酵罐(HFMF)对于实际水解物如何执行，我们使用由有专 利权的离子液体预处理方法制备的5% w/v白杨水解物。这样，共同未决的专利申请序列号 11/710，357和序列号12/075，762通过引用整体合并入本文。将200ml体积水解物首先在包含XI团块的填充床中异构化，随后在HFMF中发酵。 异构化用0. 05M硼酸盐执行24小时；91%的木糖异构化为木酮糖。发酵的结果概括于表4 中，其中显示在HFMF中来自白杨水解物的乙醇得率。 用于SIF工艺的共固定酶团块的填充床和中空纤维发酵罐模块配置的这种组合 具有几个独特和出乎意料的优点(i)它提供了不含酵母并且可以容易浓缩用于乙醇回收 的发酵醪。(ii)在乙醇已从发酵醪中蒸馏出后，包含缓冲液和硼酸根的剩余水溶液可以再 循环至上游工艺设备(即水解/异构化)，导致消耗品的显著成本节省。(iii)这种配置提 供了用于异构化催化剂团块的回收和再利用的简便方法，因为它们局限于填充床并且不与 酵母直接接触。(iv)这种配置允许木酮糖发酵所需的HFMF中酵母的高密度以及酵母用于 发酵的延伸使用。(ν)与传统发酵罐不同，酵母在每批发酵后不去除。(vi)这种配置的模 块性质使得SIF工艺容易按规模扩大，而无需显著的资本成本。与经过滤的水解物一起使用的模块SIF配置纤维素乙醇的产生受回收木质素的能力影响。在某些实施方案中，可能必须在发 酵前过滤水解物。在另一个方面，本文提供了能够使用澄清水解物的模块SIF配置。图9显示了填 充床系统10的示意性举例说明。模块SIF配置允许共固定酶的容易和快速再利用以及可 行和有效的发酵罐操作。填充床系统10包括分批容器12，具有入口 15、出口 16且包含所需量的共固定酶 团块18的填充床柱14，以及具有入口 21和出口 22的发酵罐20。在某些实施方案中，发酵 罐20包括微孔的中空纤维膜24，其使发酵罐20中的酵母26与流动通道28隔开。木糖的异构化在包含固定化酶团块18的填充床柱14中进行，而发酵在发酵罐20 中进行。分批容器12、填充床柱14和发酵罐20在闭环系统中连接，从而使得葡萄糖和木糖流动到填充床柱的入口 15内。在操作中，来自分批容器12的葡萄糖和木糖与共固定化酶团块18接触，在此发生 本文描述的异构化反应。随后葡萄糖和木糖酮从填充床出口 16流出并且流入发酵罐入口 21内。葡萄糖和木酮糖流经膜并且与酵母26接触。当酵母使用这些糖时，产生乙醇。乙醇 随后流经膜进入流动通道28内，并且通过发酵罐出口 22流出。通过使填充床系统10以串联配置连接并且通过以再循环模式操作，可达到“同时 异构化+发酵”SIF操作。填充床系统10允许团块18和发酵罐20的重复使用用于大量分 批发酵。填充床系统使酵母26局限于中空纤维膜发酵罐20 (HFMF)的壳侧，避免了酵母和 固定酶团块之间的直接接触，这使得团块的回收和再利用变得非常容易。此外，在某些实施 方案中，发酵罐20具有足够高的酵母密度以填充壳侧，从而使得酵母的进一步生长得到阻 止并且糖快速发酵为乙醇。填充床系统10对于木酮糖利用特别有利。图10和11显示了关于2种工艺的数据[(1)填充床，和(2)分开操作的HFMF。 对于填充床异构化，将0. 9g固定酶团块放置到5ml玻璃注射器的底部。使用蠕动泵，使包 含30g/l木糖、0. 05M硼酸盐和0. 05M尿素的50ml介质以Iml/分钟从储库再循环经过床， 同时维持柱中超过酶团块的Icm液压头。将填充床装置在温箱中装配，以维持34°C的恒温。 从储库中收集样品用于木糖和木酮糖的HPLC分析。用来自相同固定批次的团块的对照实 验在搅拌摇瓶中运行。关于填充床和摇瓶实验的瞬时木酮糖浓度和得率如图10中所示。发 酵速率和木酮糖的总体得率在填充床中都更高些，指示由于在填充床设计中糖向酶的质量 转移更有效，异构化的时间可能从…24小时实际减少至小于10小时。对于发酵设备，使用F50NR Hemoflow 药筒(Fresenius MedicalCare North America)。微孔纤维由具有分子量截留值25kDa的聚砜制成，并且膜总表面积为lm2。在药 筒的壳侧上的端口用于引入酵母及排出在发酵过程中产生的CO2。酵母(Sigma YSC2-500G, 25g)在纤维的壳侧上在34°C下进行接种且培养。使包含60g/l葡萄糖的250ml培养基以 l-70ml/分钟的流速泵吸经过纤维腔(50ml体积)，以确定流速对乙醇发酵速率的影响。通 过分批容器外的样品孔测量乙醇浓度。如图11中所示，葡萄糖在所有流速下均在6小时内被消耗，这与我们的分批发酵 结果是相当的(数据未显示)。对于30-50ml/分钟范围，葡萄糖甚至比我们的分批实验更 快速地被消耗，指示HFMF可能具有超过分批发酵的时间优势。乙醇得率对于所有运行接近 100%，指示最低限度的副产物生产。这些时间规模与填充柱中的异构化可比，因此提供了 超过现有技术的另一个显著优点。应当理解其他糖溶液和水解物也可以用于建立模块分筛以使SIF时间降到最低。 此外，模块可以按比例扩大以实现更大规模SIF。还应当理解，可以容易地确定关于模块的 再用性和寿命的基准。用于与含固体水解物一起使用的共固定酶的容易和快速再利用的系统如果团块与含固体水解物一起直接加入发酵容器，那么它们的回收是非常困难 的。此外，具有几个工艺优点的生物量同时糖化和发酵(SSF)需要处理含固体的发酵介质。为了解决这些情况下团块(这是残留固体的极小部分)的回收和再利用，本文还 提供了可以方便快速再利用与含固体水解物一起使用的共固定酶的系统。在一个非限制性例子中，对于更大规模的分批发酵，共固定酶团块可以固定在局限系统中。合适的局限系统的一个例子是转篮式系统30，如图12中示意性举例说明的。在这个实施方案中，酶团块32填充在扁平篮34中，所述扁平篮34形成叶轮38的 叶片36，所述叶轮38在发酵液中转动。通过改变用于篮的材料选择和通过最佳化转速，可 以使来自发酵液的固体与篮的附着降到最低。此外，在发酵过程中产生的CO2将冲击篮的 表面，进一步阻止材料积累。转篮系统30的一个优点是这种局限方法在进行异质化学反应 的大规模扩大中特别有用。图13 使用共固定酶技术的工艺配置的例子。工艺A-在pH 4.8和501下在硼酸 根和尿素的存在下，使用共固定酶团块与纤维素酶可以进行同时糖化和木糖异构化(SSI)。 所得到的葡萄糖和木酮糖的糖混合物可以通过天然酵母发酵。工艺B-在PH 4.5和351下 在硼酸盐和尿素的存在下，将共固定酶团块和天然酵母加入生物量水解物可以进行同时异 构化和发酵(SIF)，其接近于来自所有生物量糖的理论乙醇得率。工艺C-使用天然酵母的 C6和C5糖的同时糖化和发酵(SSIF)可以用共固定酶团块在维持在pH 4.8和351下的介 质中来完成，所述介质包含硼酸盐(根)、尿素、纤维素酶和天然酵母。如图13中所示，纤维素性乙醇可以在各种操作配置中产生。非限制性例子特别包 括使下述执行成为可能的共固定酶团块工艺A-同时糖化和异构化(SSI)；工艺B-同时异构化和发酵(SIF)，和工艺C-同时糖化-异构化和发酵(SSIF)。在某些实施方案中，酶XI和尿素酶在35-70°C下具有显著活性。事实上，其最佳 活性接近于50°C，正好与纤维素酶的一样。然而，与在pH 4. 8下具有最佳活性的纤维素酶 不同，关于XI的PH最佳值是7. 5。因为本文描述的方法通过产生双pH微环境可以克服这 种PH差异，所以工艺A “SSI”可以在升高的温度下进行，显著增强异构化的动力学和反应 平衡。这导致糖化和发酵所需时间的显著减少。此外，当工艺A包括向预处理过的生物量 的糖化环境中加入硼酸盐和尿素时，纤维素酶酶活性不会受这些添加剂的不利影响。此外，工艺A(“SSI”)可以用局限系统来实现，所述局限系统使糖化后酶团块的容 易回收成为可能。在工艺A( “SSI”)后，葡萄糖和木酮糖至乙醇的发酵可以通过仅降低水 解物温度和加入天然酵母在相同容器中执行。应当指出，在某些实施方案中，工艺B( “SIF”)特别适合于双层颗粒的使用。此外，在某些实施方案中，用天然酵母，仅C6糖可以在同时糖化和发酵模式 (“SSF”)中发酵为乙醇，而木糖部分仍未发酵。天然酵母无法使木糖发酵导致丧失来自生 物量水解物的接近40%的可用糖。因此，在某些实施方案中，“SSF”模式仅使用GMOs才是 可行的，所述GMOs可以在pH…4. 8下将生物量的C6和C5糖发酵。然而，如图13中可见，共固定酶技术的独特特点是它允许异构化和发酵在pH 4. 5 下发生，这也是酶促糖化的典型pH。这样可以将糖化、异构化和发酵全部组合成一个步骤。 酶团块的浓度相对于生物量的其他固体而言很低，并且预期没有纤维素酶吸附到颗粒上的 显著丧失。此外，在某些实施方案中，由于在除多糖外的固体上的非特异性吸附，向反应介 质中加入牛血清白蛋白(BSA)可以作为预防纤维素酶丧失的手段进行。尽管本发明已就各个和优选实施方案而言进行描述，但本领域技术人员应当理 解，可以作各种改变，并且等价物可以取代其要素，而不背离本发明的基本范围。此外，可以进行许多修饰以使具体情况或材料适应于本发明的教导，而不背离其基本范围。因此，预期 本发明并不限于考虑执行本发明的本文公开的具体实施方案，而是本发明将包括涵盖在权 利要求范围内的所有实施方案。参考文献上文讨论的参考文献和下述参考文献特别通过引用合并入本文，它们提供示例性 操作或其他细节来补充本文的描述。参考文献在本文中的引用不应解释为承认其为本发明 的现有技术。1. 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49. Gong 等人美国专利号 4，490, 468.
权利要求
将一种或多种糖发酵的方法，其包括i)使颗粒分散到包括硼酸根来源和木糖的混合物中，所述颗粒包括一种或多种共固定酶；和ii)将所述混合物发酵。
2.权利要求1的方法，其中所述颗粒是包含具有第一酶促活性的内核和具有第二酶促 活性的外部区域的双层颗粒。
3.权利要求2的方法，其中所述混合物具有酸性pH，并且所述内核具有基本上非酸性 的pH。
4.权利要求2的方法，其中离子性硼酸根和木糖从所述混合物扩散到所述团块的内 核，其中所述木糖被转化成木酮糖并且形成硼酸根_木酮糖复合物。
5.权利要求4的方法，其中所述硼酸根-木酮糖复合物随后迁移到所述混合物，在此所 述硼酸根_木酮糖复合物解离，释放游离木酮糖。
6.权利要求2的方法，其中所述内核的pH是约7至约8，并且所述混合物的pH是约4 至约5. 5。
7.权利要求1的方法，其中所述硼酸根来源包含四硼酸钠。
8.权利要求2的方法，其中所述共固定酶包括木糖异构酶(XI)和尿素酶。
9.权利要求4的方法，其中所述离子性硼酸根包括四羟基硼酸根。
10.将一种或多种糖发酵的方法，其包括i)使共固定酶团块分散到包含尿素、硼酸根来源和底物的混合物中，其中所述共固定 酶团块包括固定化尿素酶和除尿素酶外的作用于底物的固定化酶，和 )将所述混合物发酵。
11.权利要求10的方法，其中所述共固定酶团块包含包括固定化尿素酶的多孔外部区 域和包括除尿素酶外的、作用于底物的固定化酶的多孔内核。
12.权利要求11的方法，其中由于由尿素酶作用于扩散到所述团块的外部区域内的尿 素产生的氨的存在，所述团块的内核维持比所述混合物的PH更高的pH。
13.权利要求10或11的方法，其中所述固定化酶和所述底物在所述团块核心中反应以 产生产物，所述产物与离子化的硼酸根形成复合物。
14.权利要求12的方法，其中所述硼酸根-产物复合物随后迁移到所述混合物，在其中 所述硼酸根_产物复合物解离。
15.权利要求10或11的方法，其中所述混合物具有酸性pH，并且所述团块的至少部分 具有不同pH。
16.权利要求15的方法，其中所述团块的至少部分的pH是约7至约8，并且所述混合 物的PH是约4至5. 5。
17.权利要求10或11的方法，其中所述硼酸根来源包含四硼酸钠。
18.权利要求17的方法，其中所述离子化的硼酸根包括四羟基硼酸根。
19.用于将木糖同时异构化和发酵为乙醇的方法，其包括步骤i)使木糖、尿素和具有高乙醇生产能力与乙醇耐受性的酵母细胞在反应器中相混合， 以形成液体混合物； )使所述混合物的PH维持在约4. 0至约5. 5 ；iii)使具有至少两种酶的共固定酶颗粒分散到所述混合物中；iv)将硼酸根来源加入所述混合物中； ν)使木糖扩散到所述颗粒内；vi)通过固定的木糖异构酶的活性，使扩散的木糖异构化为木酮糖；vii)使所述木酮糖向外扩散到所述混合物中；viii)通过使尿素扩散到所述颗粒内，使所述颗粒中的液体的PH在异构化过程中维持 在约7. 0至约8. 0，由此所述尿素通过固定化的尿素酶水解为氨，所述氨中和扩散到所述团 块内的氢离子；ix)在基本上缺氧的条件搅拌所述混合物，以便允许木酮糖发酵为乙醇；和 χ)将木酮糖发酵为乙醇。
20.权利要求19的方法，其中所述颗粒是包含包括尿素酶的外部区域和包括木糖异构 酶的内核的双层团块。
21.权利要求20的方法，其中所述外部区域包括聚丙烯酰胺的聚合物包被。
22.权利要求19的方法，其中共固定所述酶的聚合物颗粒包括聚丙烯酰胺。
23.权利要求19的方法，其中所述发酵在封闭反应器中伴随搅拌进行。
24.权利要求19的方法，其中所述硼酸根来源包括四硼酸钠。
25.权利要求19的方法，其中其进一步包括下述步骤中的一个或多个 i)使所述硼酸根来源反应以产生含硼的酸； )使所述含硼的酸扩散到所述团块内，并且使所述木酮糖与所述含硼的酸反应，以产 生木酮糖_硼酸根离子复合物；和iii)使所述木酮糖_硼酸根离子复合物扩散到所述混合物中，在其中所述复合物解罔。
26.权利要求25的方法，其中所述含硼的酸包括硼酸。
27.权利要求24的方法，其中所述硼酸根离子包括四羟基硼酸根。
28.权利要求1、10、11或19中任一项的方法，其中天然酿酒酵母用于将木酮糖转化成乙醇。
29.权利要求1、10、11或19中任一项的方法，其中乙醇生产速率提高，并且C6和C5糖 发酵所需的总体时间减少。
30.用于共固定化酶团块中木糖异构化的被硼酸盐(根)增强的系统，其包括双PH环境。
31.权利要求30的系统，其进一步包括硼砂。
32.权利要求31的系统，其进一步包括，使因木酮糖与由硼砂形成的四羟基硼酸根离 子的选择性复合而引起的平衡发生正向偏移。
33.权利要求30的系统，其进一步包括能够在单个容器中维持两种不同pH的微环境的 基本上同时异构化和发酵(SIF)步骤，其中第一种pH对于木糖异构化基本上最佳，并且第 二种PH对于木酮糖发酵基本上最佳。
34.权利要求33的系统，其中所述同时异构化和发酵步骤进一步包括尿素酶与木糖异 构酶的共固定。
35.一种反应介质，其中包含木糖、硼酸根来源和尿素。
36.一种填充床系统，其中包含以串联形式与多孔中空纤维膜发酵罐连接的共固定化 酶颗粒。
37.权利要求36的系统，其进一步包括基本上不含酵母的发酵醪，所述发酵醪可以浓 缩用于乙醇回收。
38.权利要求36的系统，其包括包含缓冲剂和硼酸盐(根)的再循环水性溶液。
39.权利要求36的系统，其包括局限于填充床以便不与酵母直接接触的异构化催化剂颗粒。
40.权利要求36的系统，其在发酵罐中包括高密度的酵母。
41.权利要求40的系统，其中所述酵母在每批发酵后不去除。
42.一种异构化和发酵系统，其包括填充在局限系统中的共固定化酶颗粒，所述局限系 统在发酵液中转动。
43.一种异构化和发酵系统，其配置为基本上同时执行一个或多个工艺。
44.权利要求43的系统，其中所述工艺包括下述中的一个或多个同时糖化和木糖异 构化(SSI)工艺；同时异构化和发酵(SIF)；以及同时糖化和发酵(SSIF)。
45.权利要求43的系统，其中使用共固定化酶颗粒。
46.权利要求45的系统，其中所述颗粒是双层颗粒。
全文摘要
本发明公开了用于木糖和己糖的异构化和/或发酵的方法和系统。
文档编号C12N1/00GK101932695SQ200980103397
公开日2010年12月29日 申请日期2009年1月2日 优先权日2008年1月4日
发明者D·袁, K·拉奥, P·A·雷率, S·巴兰纳西 申请人:托莱多大学