一种利用茶果壳制备木糖醇的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及木糖醇的制备方法，尤其涉及利用茶果壳制备木糖醇的方法。
【背景技术】
[0002]木糖醇是一种白色结晶体，其甜度与蔗糖相当，能量相当于葡萄糖，因其具有防龋功能，人体代谢不需要胰岛素参与，同时能改善多种疾病具有很好的效果，被应用在很多领域。
[0003]起初生产木糖醇都采用物理、化学的方法，存在诸多弊端。目前木糖醇的生产工艺还是以化学法为主，一般以富含戊聚糖的植物纤维为原料，经过水解、纯化及离子交换等步骤得到木糖，但是生产过程中产生的污水较多，严重的污染了环境，并且收率低。
[0004]1966年Onishi和Suzuki首次报道了酵母菌能够利用D-木糖生产木糖醇后，国际上许多学者都对发酵法生产木糖醇的研宄产生了很大的兴趣。目前的研宄发现，一些细菌、酵母菌以及某些真菌能将木糖转化，生成木糖醇。其中，酵母菌是最有效的木糖醇生产菌。相较于传统的木糖醇生产方法，利用酵母还原木糖生成木糖醇是一条更为经济的工艺路线，因为发酵生产木糖醇无需化学法所必不可少的木糖纯化步骤，还可以简化木糖醇的分离步骤。此外，以酵母细胞作为木糖氢化的催化剂其过程耗能也较低。尽管某些天然利用木糖的微生物如树干毕赤氏酵母，在代谢过程中产生木糖醇，但将其直接用于工业生产则存在着许多局限性。首先，对这些酵母菌而言，木糖是碳源及能源物质，有相当部分的木糖要转变为生物量，影响木糖醇得率的提高；其次，这些微生物往往对木质纤维材料水解物中的毒性成分，如糠醛抗性很低，难以适应工业生产的要求；而且某些这类微生物的自身特性(如产生毒素等)不适用于食品及相关工业。酿酒酵母是公认的安全性微生物，应用于食品发酵已有上千年的历史，发酵工艺成熟，是理想的工业生产菌株，且自身不具有代谢木糖的能力。木糖还原酶转化木糖为木糖醇，是木糖代谢的第I步。在酿酒酵母工业菌株中稳定高效表达木糖还原酶基因，是构建酿酒酵母木糖醇生产菌株的基本策略。近年来国外学者进行了许多相关的研宄，并取得了可喜的成果。有将木糖醇磷酸脱氢酶基因整合到枯草芽孢杆菌细胞中的(Mira Povelainen, 2007年)；有以谷氨酸棒杆菌做为宿主的(So-Hyun Kim, 2010年)；但是更多的是将毕赤酵母木糖还原酶基因整合到酿酒酵母细胞内(Xiaoran Zhang, 2010 年;Eun_Joong Oh, 2012 年；Soo Rin Kim, 2012 年)，并得到很好地表达。
[0005]本项目拟以茶果壳原料，采用生物转化法生产木糖醇，可省去多次提纯、精制步骤，提高木糖利用率和木糖醇转化率，实现木糖醇低成本的关键技术突破，增加农民收入，提高我国木糖醇国际占有量和竞争力。
【发明内容】
[0006]为了得到质量高、成本低廉的木糖醇，本发明提供一种原材料新颖、反应条件温和、成本低、绿色生产、环境友好，易于实现工业化的木糖醇的制备方法。
[0007]本发明采用如下技术方案:
一种利用茶果壳制备木糖醇的方法，具体步骤如下:
(1)水解:将原料茶果壳洗净，烘干后破碎，置于水解釜中，加入原料茶果壳质量3?4倍的水，煮沸90?120min，排水后再加入原料茶果壳质量5?6倍的0.5wt%?lwt%硫酸，即0.5wt%? lwt%硫酸水溶液，在120?130°C，0.1?0.15MPa的条件下水解3?5h，得到水解液；
(2)中和:将步骤(I)所得水解液升温至75?80°C，边搅拌边加入CaC03乳液进行中和，中和至pH为3.5?4.0后，保温60?80min，过滤除渣，得到糖液；
(3)脱色:将步骤(2)所得糖液减压浓缩至所述糖液体积的1/5?1/7倍，滤除析出的固体，升温至75?80°C，pH调为2.5?3.5，边搅拌边加入活性炭A进行脱色，脱色后滤除活性炭，得到脱色后的糖液；
(4)离子交换:对步骤(3)所得脱色后的糖液进行离子交换，采用732型强酸性阳离子树脂和D201型强碱多孔阴离子树脂进行交叉处理，所述交叉处理的方法为:先用所述阳离子树脂对脱色后的糖液进行离子交换，再用所述阴离子树脂进行离子交换，以此为一个周期，重复进行I?3次，得到离子交换后的糖液；
(5)发酵:首先配制培养基:将步骤(4)所得离子交换后的糖液、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、水混合即得到培养基，接入以热带假丝酵母Candidatripicalis，保藏号:AS2.1776为出发菌株制得的酶源，在200?220r/min，28?32°C的条件下发酵48?52h，得到发酵液，然后将所得发酵液在8000?1000rpm下离心20?25分钟，取上清液，纯化得抽提液冷却后析出晶体，过滤收集晶体并干燥，得到产物木糖醇；所述培养基中，所述糖液中的木糖的终浓度为120?150g/L，所述酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨的终浓度分别为8?12g/L，溶剂为水，初始pH为5.0?6.0。
[0008]本发明所述的制备木糖醇的方法，步骤(I)中，推荐将所述茶果壳烘干后破碎至粒度为3?5mm。
[0009]步骤(2)中，由于所述水解液仍含残余的硫酸，pH值为2.5左右，因此加入CaC03乳液进行中和，优选所述CaC03乳液波美度为15?17度。
[0010]步骤(3)中，由于浓缩后的糖液颜色较深，因此利用活性炭A进行脱色处理，优选所述活性炭A的质量用量为所述糖液质量的8%?12%，脱色后所述糖液的透明度(折光度)为30%?40%。
[0011]步骤(4)中，通过离子交换处理进一步净化所述糖液，可使所述糖液的透明度(折光度)达94%?97%，糖液呈无色透明状。
[0012]步骤(5)中，在配制培养基前，可以通过紫外可见分光光度法测得所述糖液中木糖的含量，从而在配制培养基时，可通过调节水量使木糖的终浓度满足本发明所述的浓度范围。
[0013]步骤(5)中所述的纯化方法为:所述上清液，加入活性炭B，调节pH至4.8?5.2，煮沸，冷却至室温，抽滤，取滤液在50?55°C下减压蒸干得到固体物质，并在50?55°C下用无水乙醇抽提得抽提液；所述活性炭B的质量用量以所述上清液的体积计为18?25g/L。
[0014]步骤(5)中，所述的出发菌株热带假丝酵母(Candida tripicalis，菌种保存号:AS2.1776)，购自中国普通微生物菌种保藏中心(北京)。
[0015]步骤(5)中，所述的酶源为所述的热带假丝酵母种子液，推荐所述热带假丝酵母种子液的接种体积量是所述培养基体积的5%?15%，所述的热带假丝酵母种子液按如下方法制得:
(1)斜面培养:将热带假丝酵母菌Candidatripicalis，保藏号:AS2.1776接种至斜面培养基，30°C培养3?4天，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为:酵母膏1.5?5g/L，蛋白胨2?5g/L，琼脂粉18?25g/L，木糖30?50g/L，pH 5?6，溶剂为水；
优选斜面培养基终浓度组成为:酵母膏2g/L，蛋白胨3g/L，琼脂粉20g/L，木糖40g/L，溶剂为水，PH 5.5 ；
(2)种子培养:从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30°C、200rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为:葡萄糖5?15g/L，D-木糖5?15g/L，酵母膏1.5?5g/L，蛋白胨2?5g/L，麦芽汁2?5g/L，pH 5?6，溶剂为水；优选种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/L，D-木糖10g/L，酵母膏2.0g/L，蛋白胨3.0g/L，麦芽汁3.0g/L，pH 5.5，溶剂为水。
[0016]对步骤(5)中所得发酵液进行成分分析，其中，木糖醇浓度为75g/L?90g/L，残存木糖浓度为5g/L?10g/L，木糖醇转化率为60%?70%。
[0017]本发明中，“活性炭A”、“活性炭B”没有特殊的含义，均指一般意义上的活性炭，标记为只是用于区分不同步骤中用到的活性炭。
[0018]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(1)使用茶果壳为原材料，在国内外未见相关的报道和应用；
(2)本发明的整体生产工艺过程反应温和，不需要使用化学催化剂，以热带假丝酵母Candida tripicalis，保藏号:AS2.1776为出发菌株制得酶源，对环境污染较小，由于微生物菌种的特性和微生物酶作用的专一性，反应终产物单一，使得提取和精制容易，生产成本低；
(3)发酵液离心后的剩余物主要成分是单细胞蛋白，可以进一步开发利用。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例一
(1)茶果壳的选择选用茶果壳作原料；
(2)水解
将选好的茶果壳用清洗机清洗干净，烘干后破碎，将破碎后的茶果壳(粒度为3mm) 10g放入水解釜，加入300g水，升温至100 °C煮沸90min，排水后再加入500g
0.5wt%的硫酸，然后升温至120°C，在0.1MPa的压力条件下水解3h，得到水解液；
(3)中和<