能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌和使用该细菌生产生物乙醇的方法

专利名称：能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌和使用该细菌生产生物乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发酵细菌菌株和用于使用该细 菌菌株从纤维素类型或木质纤维素类型生物质生产生物乙醇的方法。背景领域在日本，不用的生物质源即纤维素类型工业(一般)废料例如森林抚育间伐 (forest thinning)、施工废弃物(construction waste materials)、稻草禾口谷壳以及 旧纸和废纸的产量达到每年5千万吨。此类生物质作为能源的用途被认为是“碳中和 (carbon-neutral) ”，因为它们不扰乱全球C02平衡，从而高度期望生物质作为促进温室气 体减少的能源。在这样的情况下，已提出并且研究了从不用的纤维素类型或木质素类型生 物质源产生生物燃料和使用产生的生物乙醇作为合成用于加入汽油或化学制品的含氧化 合物的原料或作为区域热源和电力源。然而，自然界中不存在可获得的通过直接降解和发酵纤维素类型或木质纤维素类 型生物质源生产乙醇的发酵细菌。因此，期望通过使用代谢工程技术和细胞表面呈现技术 (cell surface presentation technology)产生发酵细菌，所述细菌能够同时发酵以混合 物的形式存在于纤维素和半纤维素的酸处理糖化溶液中的纤维素部分降解产物(纤维素 寡糖)、木糖和甘露糖并且将其转化成乙醇。还期望构建新型节能高效转化方法，在该方法 中整合了具有培育的发酵菌株作为催化剂成分的连续发酵装置。本发明者之前通过将编码至少一种酶(选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶 和转酮醇酶)的外源基因导入不能够同化戊糖的发酵细菌属(Zymobacter)的微生物成功 地产生了能够从戊糖生产乙醇的转化微生物(专利文献1)。为了从含有甘露糖的原料高 效地生产乙醇，本发明者还通过将编码磷酸甘露糖异构酶的外源基因整合入发酵单胞菌属 (Zymomonas)的细菌的染色体(以为细菌提供稳定的甘露糖发酵能力)成功能地产生重组 微生物(专利文献2)。专利文献1 JP 2005-261421A专利文献2 JP 2007-14306A本发明的公开内容有待本发明解决的问题本发明的目的是产生能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发酵细菌，其可通过 同时将存在于糖化溶液(获自草本来源和特别地木质来源的纤维素类型和木质纤维素类 型生物质源)中的纤维寡糖、木糖和甘露糖发酵和转化成乙醇来生产乙醇。本发明的另一 个目的是建立适合于实际用途的新型节能高效生物乙醇转化方法。用于解决问题的方法发酵单胞菌属的细菌已知为用于酿造龙舌兰酒(tequila)的细菌，与常规酿酒酵 母相比，此类细菌在乙醇发酵的速度和生产率上优良3至5倍，并且在每单位细菌细胞乙醇 的生产率上优于酵母。然而，发酵单胞菌属的细菌不能够发酵存在于纤维素类型或木质纤维素类型生物质源中的麦芽糖或木糖来生产乙醇。本发明者的目的在于发酵单胞菌属的细菌的优良乙醇生产率，并且假定能够同时 发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌可通过应用由本发明者提交的上述专利文献1和2中描 述的技术生成，以完成上述目的。因此，作为详尽研究的结果，本发明者已完成了本发明。gp，本发明提供了 (1)能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发酵细菌，其为包含整合入(按照同源 重组法，通过双交换)位于染色体上的蔗糖6-果糖基转移酶(Ievansucrase)基因的大肠 杆菌(E. coli)来源的编码磷酸甘露糖异构酶的基因和导入的重组DNA的运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)，所述导入的重组DNA通过将包含分别编码木糖异构酶、木酮糖激酶、 转醛醇酶和转酮醇酶的基因(全部都为大肠杆菌来源)的DNA片段连接至载体来形成；(2)根据上述⑴的发酵细菌，其可通过使用高蔗糖6-果糖基转移酶产生性菌株 作为宿主菌株而获得；(3)根据上述(2)的发酵细菌，其中宿主菌株是运动发酵单胞菌ZMcs(FERM BP-I1024)；(4)根据上述(3)的发酵细菌，其为运动发酵单胞菌ZM mx42(FERMBP-11025)。(5)用于生产乙醇的方法，其包括使纤维素类型和/或木质纤维素类型生物质源 的糖化溶液和根据权利要求1的能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发酵细菌(其已被 固定在固定的载体上)彼此接触，从而发酵糖化溶液以获得发酵溶液，以及从发酵溶液回 收乙醇；(6)根据上述(5)的生产乙醇的方法，其中发酵细菌是运动发酵单胞菌ZM mx42(FERM BP-I1025)；(7)根据上述(5)的生产乙醇的方法，其中生物质源是木质生物质源；和(8)根据上述(5)的生产乙醇的方法，其中将糖化溶液连续进料入充填有固定化 发酵细菌的反应器，从而使糖化溶液与发酵细菌彼此接触，以获得发酵溶液，连续收集发酵 溶液，以及从其回收乙醇。本发明的效果在从木质和草质生物质源的酸处理糖化溶液高效生产乙醇中，为待使用的细菌提 供葡萄糖、甘露糖和木糖的同时发酵能力是非常重要的，所述葡萄糖、甘露糖和木糖来源于 纤维素和半纤维素并且作为混合物存在于糖化溶液中。然而，运动发酵单胞菌不具有甘露 糖或木糖的发酵能力，虽然其具很强的葡萄糖发酵能力。至于甘露糖发酵能力，运动发酵单胞菌不能充足地表达甘露糖激酶和磷酸甘露糖 异构酶，特别地磷酸甘露糖异构酶(其是甘露糖代谢不可缺少的)。根据本发明，可能通过 导入和表达大肠杆菌来源的磷酸甘露糖异构酶基因(manA)为运动发酵单胞菌提供甘露糖 发酵能力，以及通过将基因整合入染色体进一步产生稳定的甘露糖发酵能力。此外，虽然细 菌中木糖的代谢通常需要4种酶，即木糖异构酶和木酮糖激酶以及转醛醇酶和转酮醇酶， 所述酶是磷酸戊糖途径的必需酶，但运动发酵单胞菌缺少木糖异构酶和木酮糖激酶，从而 不能够利用木糖。因此，根据本发明，可通过导入木糖异构酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因 (xylB)、转醛醇酶基因(tal)和转酮醇酶基因(tktA)(全部都为大肠杆菌来源)为运动发 酵单胞菌提供木糖发酵能力。因此，可通过导入manA基因和木糖代谢的酶系统的基因来给运动发酵单胞菌提供三种糖即葡萄糖、木糖和甘露糖的发酵能力。可通过将所产生的能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌菌株固定在固定载 体上以构建用于生物乙醇的连续产生的反应器，并且将生物质源的糖化溶液连续导入反应 器以使糖化溶液与发酵细菌菌株彼此接触来进行乙醇发酵。附图概述

图1是举例说明用于将manA整合入染色体DNA的方法的图解。图2是举例说明用于克隆大肠杆菌来源的manA的方法的图解。图3是举例说明用于构建用于染色体DNA的整合的重组质粒pUZE2d’ -manA的方 法的限制性图谱。图4是举例说明用于构建pUC118-xylAB的方法的限制性图谱。图5是举例说明用于构建pUC118-tal的方法的限制性图谱。图6是举例说明用于构建pUC118-tkt的方法的限制性图谱。图7是举例说明用于构建pUC118-tal+tkt的方法的限制性图谱。图8是举例说明用于构建pZA22_xt的方法的限制性图谱。图9是举例说明实施例2(4)中木糖的发酵测试的结果的图。图10是举例说明为细菌菌株提供葡萄糖、甘露糖和木糖的同时发酵能力的方法 的图解。图11a是举例说明实施例3中培育的菌株的发酵测试的结果的图解。图lib是举例说明实施例3中培育的菌株的发酵测试的结果的图。图12a是举例说明实施例4中废木料糖化溶液的发酵测试的结果的图。图12b是举例说明实施例4中废木料糖化溶液的发酵测试的结果的图。图13是举例说明用于实施例5中的连续发酵的条件的反应器的示意图。图14是举例说明实施例6中模型酸处理糖化溶液的连续发酵的结果的图。图15是举例说明实施例6中初始培养基pH在模型酸处理糖化溶液的连续发酵中 的影响的图。图16是举例说明实施例6中废木料的酸处理糖化溶液的连续发酵的结果的图。图17是举例说明实施例中6中使用酸处理糖化溶液进行连续乙醇生产的结果的 图。用于进行本发明的最佳模式宿主菌株根据本发明已向其提供了甘露糖发酵能力的运动发酵单胞菌可以是通常用于乙 醇生产的运动发酵单胞菌，但从增加木糖发酵能力的观点来看，优选的是在下文中描述的 高蔗糖6-果糖基转移酶产生性菌株，其作为天然突变的结果而发生并且产生比野生型菌 株所产生的更大量的蔗糖6-果糖基转移酶。为细菌菌株提供甘露糖发酵能力编码用于提供甘露糖发酵能力的磷酸甘露糖异构酶(manA)的基因可从大肠杆菌 获得，所述大肠杆菌是能够降解甘露糖的供体微生物。分离和纯化编码供体微生物的磷酸甘露糖异构酶的DNA，然后通过各种方法切割 DNA以获得DNA片段。此外，利用例如DNA连接酶将DNA片段连接至可根据相同方式获得的载体DNA片段以形成含有磷酸甘露糖异构酶基因的重组DNA。可以例如通过使用可商 购获得的DNA提取试剂盒，按照相关领域中的已知方法例如Molecular Cloning，第3版 (J. Sambrook，等人，Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中描述的方法进行技术例如 DNA的分离和纯化、DNA片段的制备和利用DNA连接酶进行的连接。可以按照已知的同源重组方法，通过双交换进行至染色体内的整合。即，将蔗糖 6-果糖基转移酶基因克隆为运动发酵单胞菌的染色体靶基因，然后将编码磷酸甘露糖异构 酶的外源基因插入已在体外克隆的染色体靶基因来制备其中靶基因的部分分别连接至外 源基因的上游和下游的DNA，接着将该DNA整合入位于运动发酵单胞菌的染色体上的靶基 因。例如，如图1中所示，使蔗糖6-果糖基转移酶基因(在下文中称为E2)与运动发酵单 胞菌的染色体DNA上的转化酶(在下文中称为E3)协同作用。这两种酶存在于运动发酵单 胞菌的细胞表面上，利用蔗糖作为底物释放果糖，从而催化转移反应以形成果聚糖。靶向E2 位点，使用同源重组方法通过双交换将磷酸甘露糖异构酶基因整合入其中以缺失E2。作为 结果，可能从形成果聚糖的果糖生产乙醇。在另一方面，与导入载体的菌株不同，导入的基 因的稳定性增加。因此，不需要试剂例如标记。用于提供木糖发酵能力的重组载体的构建作为能够降解木糖的微生物，大肠杆菌用作DNA供体，将编码木糖异构酶、木酮糖 激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的DNA从其分离并且进行纯化。然后，通过各种方法切割DNA以 制备编码酶的片段。通过例如DNA连接酶将此类DNA片段连接至合适的载体DNA片段。从 而形成含有木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因的重组DNA。可通过本身已知的方法，例如由Saito和Miura (Biochem. Biophys. Acta,第72卷， 619-629，1963)提出的方法或其改良方法，或使用商业DNA提取试剂盒的方法从供体分离 和纯化DNA。通过例如限制性内切酶切割获得的供体微生物的DNA，通过蔗糖密度梯度方法除 去短于Ikbp的DNA片段。然后，可将剩余的片段用作供体DNA片段。此时使用的限制性内 切酶不受特别限制，除了上述酶促方法外，还可能通过使用例如超声或物理剪力切割DNA。 此时，优选，使用例如Klenow片段或酶例如DNA聚合酶或绿豆核酸酶处理供体DNA片段的 末端，因为随后与载体DNA结合的效率增加。此外，通过使用供体微生物的DNA或其片段作 为模板获得的PCR扩增产物也可直接用作供体DNA片段或在应用上述处理后用作供体DNA 片段。载体DNA片段不受特别限定，但是例如可适当地使用穿梭载体pZA22。可在与供体DNA片段结合反应前使用碱性磷酸酶处理获得的载体DNA片段，从而， 增强片段与供体DNA片段的连接效率。此外，在通过PCR扩增制备供体DNA片段的情况下， 还可通过预先使用引物(其在扩增片段的两个末端上提供限制性位点例如EcoRI)来增加 连接效率，同时通过用与用于切割扩增片段的限制性内切酶相同的限制性内切酶切割载体 来制备待使用的载体片段。供体DNA片段和载体DNA片段的连接反应可通过使用常规方法 例如使用已知的DNA连接酶的方法来进行。例如，在将供体DNA片段和载体DNA片段退火 后，可在适当的DNA连接酶的作用下离体产生重组DNA。需要时，在退火后，可将片段导入宿 主微生物，可通过利用体内DNA修复能力产生重组DNA。具有葡萄糖、甘露糖和木酮的同时发酵能力的细菌菌株的产生
将含有木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因的重组 DNA载体导入上面获得的已为其提供了甘露糖发酵能力的运动发酵单胞菌。用于导入重组DNA载体的方法不受特别限定，但通过利用电刺激的方法例如电穿 孔适当地导入重组DNA。将已向其中导入重组DNA载体的菌株培养在木糖平板培养基上，将在其上形成的 集落培养在含有木糖和甘露糖作为碳源的液体培养基中。监控生长，选择在木糖和甘露糖 的碳源中都展示高生长的转化菌株以获得能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的期望的细 菌株。用于来自生物质源的糖化溶液的连续发酵反应器的构建本发明的发酵细菌可用于从木质类型或草质类型的任何生物质源的糖化溶液生 产乙醇，但考虑到其高乙醇生产率，细菌可适合用于从木质生物质源的糖化溶液生产乙醇。例如，通过化学或物理处理水解原料木材来制备糖化溶液，该溶液用作用于发酵 的原料。该木材的糖化溶液包含来源于作为木材的组成成分的纤维素和半纤维素的葡萄 糖、木糖和甘露糖的混合物。迄今，一直通过使用酵母(所述酵母用作常规啤酒酿造者的真菌)的木材的糖化 溶液的分批类型或连续类型发酵生产生物乙醇。在这样的生产方法中，木材的糖化溶液中 包含的木糖或甘露糖(大约20%)不能被转化成生物乙醇。因此，从木材的糖化溶液回收 生物乙醇只限定于来自葡萄糖组分的生物乙醇(大约50%)。这是增加生物乙醇的成本的因素。在本发明中，可通过使用上述发酵细菌菌株，通过将木材的糖化溶液连续补料至 反应器(所述反应器充填有已固定在固定化载体上的细菌菌株，从而允许糖化溶液与发酵 细菌菌株彼此接触)来以高回收率高速地生产生物乙醇。因此，可能获得相应于木糖和甘 露糖的量的大约20%的生物乙醇的进一步回收和成本下降(当与常规方法相比较时)。可按照本身已知的方法例如包含法(inclusion method)、物理吸附法或共价键合 法进行至固定载体的固定。适合的载体是具有例如中空形状、凹凸形状或多孔形状和具有每单位体积大表面 积的载体或通过吸水膨胀的载体。适当的载体应当具有流动性和足够的颗粒大小和比重， 以防止其容易地流出反应系统。载体可以以例如板、纤维、特殊形状例如圆柱形、海绵、颗粒 或团块或立方体的形式存在。在它们当中，由于容易获得流动性和充足的表面积，微粒剂是 优选的。可用的材料包括各种有机和无机材料，所述材料已常规用作用于微生物或酶的载 体的材料。其实例包括无机材料例如颗粒活性碳、粉末状活性碳、木炭、沸石、云母和沙粒； 树脂材料例如光敏树脂(photocurable resin)、聚氨基甲酸乙酯(polyurethane)、聚乙烯 醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、纤维素、葡聚糖、琼脂糖和 离子交换树脂；多孔陶瓷例如硅胶；无烟煤(anthracite)；硅藻土 ；和树脂材料与活性碳的 混合物。它们可单独使用或以其两种或更多种的组合使用。通常通过用固定载体充填生物反应器来使用固定载体。根据机制和功能的差异， 用于发酵的生物反应器的实例包括完全混合罐类型、填充床类型、膜类型、流化床(fluid bed type)和卧式类型(horizontal type)的反应器。这样的生物反应器是适合使用的，因 为所述生物反应器使得可能进行连续发酵而不需要微生物的进料和回收。
当如上所述进行乙醇发酵时，必要时可将用于微生物的各种营养物来源整合入糖 化溶液中，以及可将例如，酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、肉膏(meat extract)和鲣提取物 (bonito extract)用作氮源。在下文中，通过下列实施例更详细地描述本发明，但本发明无意限定于其。实施例1磷酸甘露糖异构酶基因(manA)的整合(1)大肠杆菌(E. coli)来源的磷酸甘露糖异构酶基因(manA)的克隆使用表1中显示的合成的寡核苷酸的组合，通过PCR扩增含有靶基因的DNA片段， 所述寡核苷酸是基于已知的运动发酵单胞菌(Zm. mobilis)来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶基 因序列(J. Bacteriol.第169卷(12)，5653-5662，1987)和已知的大肠杆菌来源的manA核 苷酸序列(Gene 32 (1-2)，41-48 (1984))设计的。首先，使用运动发酵单胞菌(IF013756)的野生型菌株的染色体DNA(Chr. DNA)作 为模板进行第一 PCR以扩增gap启动子。类似地，使用大肠杆菌K12菌株的Chr. DNA作为 模板扩增manA。然而，将两个PCR产物用于形成异源双链(hetero-double strand)。进行 第二 PCR以构建gap-manA片段，然后将该片段连接至载体pUC118的HincII位点。用所得 的产物转化大肠杆菌JM109菌株。对插入片段进行测序，作为结果，插入片段的核苷酸序列经确认与数据库中记录 的manA的核苷酸序列一致。因此，将产物称为pUCl 18-manA.图2概述了该克隆操作。表 1manA 引物manA(l) (SEQ ID NO 1)CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCGmanA(2) (SEQ ID NO 2)CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAAmanA(3) (SEQ ID NO 3)TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAGmanA (4) (SEQ ID NO 4)CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA(2)用于染色体整合的载体pUZE2d’ -manA的构建图3是举例说明通过靶向E2位点来构建用于染色体整合的载体的构建的图。用Ndel处理载体pUZE2d(4. 8kb)，进行平端处理，然后用BAPP处理以切取DNA。 此外，用 BamHI 和 EcoRI 从 pUC118_manA(4. 8kb)降解(digest) Pgap-manA (1. 5kb)，然后平 端化以切取manA片段。然后使用Ligation High和T4连接酶在4°C和16°C下进行连接过 夜，通过热激法进行大肠杆菌JM109菌株的转化以提取质粒。使用表2中显示的manA(l) 和manA(4)引物，通过PCR从提取的质粒确认1. 5kbp的manA片段，所述引物是基于已知的 运动发酵单胞菌的基因组 E2 序列(Biosci. Biotech. Biochem.，59 (2)，289-293 (1995) ；DNA 登录号D17524(DDBJ，EMBL))设计的。此外，当用EcoRV和Kpnl降解质粒时，检测到5. 3kbp 片段的条带，这显示片段由相对于E2基因以正向存在的4. 8kbp和1. 5kbp片段组成。根据该结果，将质粒称为质粒pUZE2d’ -manA。表2E2 引物E2(l) (SEQ ID NO 5)ACTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGTTGAATAAAGCAGGCATTGCAGAE2(2) (SEQ ID NO 6)GCTCTAGATCATTATTTATTCAATAAAGACAGGGCE2(3) (SEQ ID NO 7)AGCAAATAATTTCTGGGATTTCCGCE2(4) (SEQ ID NO 8)AGGCCGCTCCGTCTGG(3)manA至运动发酵单胞菌的染色体DNA内的整合的确认选择大量产生蔗糖6-果糖基转移酶的菌株(其来源于通过自然突变产生的运动 发酵单胞菌IF013756(在下文中称为ZM ms菌株))作为宿主菌株，使用高浓度质粒溶液，通 过电穿孔方法进行宿主菌株的转化。然后，进行3次连续传代培养，将培养物用于2%甘露 糖-RM平板。从应用后第3天开始，将培养物连续培养大约2周，任意地选择生长在其中的 大集落，将其接种入2%甘露糖-RM液体培养基。从培养细胞的悬浮液收获细菌细胞，用无 菌Mi 11 iQ水清洗细胞一次，然后将其悬浮于ImL的无菌Mi 11 iQ水中以制备用于DNA提取的 样品。使用manA引物HianA(I)和manA (4)以及E2引物E2(l)和E2 (2)将50 μ L提取物中 的1 μ L经历PCR扩增。作为结果，在使用manA引物的扩增中检测到manA片段(1. 5kbp)， 在使用E2引物的扩增中在2. Skbp处检测到条带。该结果显示manA插入在染色体DNA的 E2位点上，因为2. 8kbp相应于通过将manA (1.5kbp)整合入E2(1.3kbp)而制备的片段的长 度。自2007年8月13日以来，菌株ZM ms由日本产业技术总合研究所国际专利生物 保藏所(International Patent Organism Depository,NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology), tsukuba Central6,1-1-lHigashi, Tsukuba
305-8566，Japan在布达佩斯条约的条款下于登1录号FERM BP-11204下保藏。、实施例2为细菌菌株提供木糖的同时发酵能力为了将大肠杆菌来源的木糖代谢系统中的酶的基因导入运动发酵单胞菌，首先， 使用载体PUC118将xylA、xylB、tal和tktA的基因在大肠杆菌中克隆，然后插入用于大肠 杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭载体PZA22以构建重组质粒pZA22-xt。然后，将pZA22_xt导 入已通过将manA整合入其染色体而为其提供了甘露糖发酵能力的运动发酵单胞菌。从而， 为菌株提供了葡萄糖、木糖和甘露糖的同时发酵能力。(l)pUC118-xylAB 的构建通过PCR从大肠杆菌基因组DNA克隆必需基因。此外，将用于控制3_磷酸甘油醛 脱氢酶的表达的启动子基因(GAP启动子)(据报导其在运动发酵单胞菌细胞中大量表达) 用于在运动发酵单胞菌细胞中表达导入的4种酶基因。
通过PCR克隆大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因。S卩，基于已 知的运动发酵单胞菌来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因序列(J. Bacteriol.，第169卷 (12), 5653-5662,1987)和已知的大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的核 苷酸序列(Appl. Environ. Microbiol.，第47卷(1)，15-21，1984)设计表3中显示的4种类 型的PCR引物，以制备DNA片段，其中将大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因 串连在运动发酵单胞菌来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子基因的下游离，分别在 DNA片段的两个末端上提供用于克隆的EcoRI限制性切割位点。表3XYL 引物XYLl (SEQ ID NO 9)CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCGXYL2(SEQ ID NO 10)TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGATXYL3(SEQ ID NO 11)ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTAXYL4(SEQ ID NO 12)CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA对于第一 PCR，通过使用从运动发酵单胞菌细胞制备的基因组DNA (作为模板)以 及引物XYLl和XYL3来扩增含有木糖异构酶基因的启动子和N末端位点的大约300bp的 DNA片段。在另一方面，通过使用大肠杆菌基因组DNA(作为模板)以及引物XYL2和XYL4 来扩增含有启动子基因的一部分、木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的大约3. Okbp的DNA 片段。然后，将含有启动子基因的DNA片段与含有木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的DNA 片段混合并且在94°C下加热20分钟。将混合物在37°C下保持15分钟以形成异源双链体。 在TaqDNA聚合酶存在的情况下，让异源双链体在72°C下反应3分钟。向该反应混合物中 加入引物XYLl和引物XYL4，进行第二 PCR以扩增大约3. 2kbp的片段，在该片段中，Gap启 动子基因、木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因以该顺序连接。在将该DNA片段的两个末端 经历平端化反应后，将DNA片段与用HincII限制性内切酶切割的用于大肠杆菌的载体质粒 DNA PUC118的片段混合，然后用T4连接酶连接以产生重组质粒DNA。根据常规方法将所产 生的重组质粒用于转化大肠杆菌JM109，然后将转化菌株用于含有50yg/mL氨苄青霉素、 0. ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷和20 μ g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖吡 喃糖苷的LB平板培养基(1% Bacto Tripton,0. 5%酵母提取物、1 % NaCl和1. 5%琼脂) 以形成集落。从形成白色集落的转化菌株提取的重组质粒称为pUC118-xylAB。图4概述该操作。(2)pUC118_taltktA 的构建转醛醇酶基因和转酮醇酶基因在大肠杆菌基因组DNA上不构成操纵子，并且它们 的位置彼此远离。因此，分别克隆转醛醇酶和转酮醇酶，然后连接以使它们受运动发酵单胞 菌来源的GAP启动子控制。为此目的，基于已知的运动发酵单胞菌来源的烯醇化酶的基因 序列和已知的大肠杆菌来源的转醛醇酶基因(Nucleic Acids Res.，第20卷，3305-3308， 1992)设计表4中显示的4种类型的PCR引物。
表 4TAL弓丨物TAL1(SEQ ID NO 13)CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAATAL2(SEQ ID NO 14)AAGATTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGTTAL3(SEQ ID NO 15)ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATATCGAAACCTTTCTTAAAATCTTTAL4(SEQ ID NO 16)CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC对于第一 PCR，将从运动发酵单胞菌细胞制备的基因组DNA用作模板，将引物TALI 和TAL3用于扩增大约300bp的DNA片段，该片段含有转醛醇酶基因的启动子和N末端位点 并且在启动子基因的上游末端具有添加的Xhol限制性切割位点。在另一方面，通过使用 大肠杆菌基因组DNA (作为模板)以及引物TAL2和TAL4扩增大约1. 2kbp的DNA片段，该 片段含有启动子基因的一部分和转醛醇酶基因并且在转醛醇酶基因的C末端上具有添加 的Xbal限制性切割位点。然后，将含有启动子基因的DNA片段和含有转醛醇酶基因的DNA 片段混合并且在94°C下加热20分钟，然后将混合物在37°C下保持15分钟以形成异源双链 体。然后，在TaqDNA聚合酶存在的情况下，让异源双链体在72°C下反应3分钟。向该反应 混合物中加入引物TALI和引物TAL4，进行第二 PCR以扩增大约1. 3kbp的DNA片段，在该 片段中，Eno启动子基因和转醛醇酶基因以该顺序连接。在将该DNA片段的两个末端经历 平端化反应后，将DNA片段与用HincII限制性内切酶切割的用于大肠杆菌的载体质粒DNA PUC118的片段混合，然后用T4连接酶连接以产生重组质粒DNA。根据常规方法将所产生的 重组质粒用于转化大肠杆菌JM109，然后将转化菌株用于含有50 u g/mL氨苄青霉素、0. ImM 异丙基_ 0 -D-硫代半乳糖苷和20 u g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-0 -D-半乳糖吡喃糖苷 的LB平板培养基(1% Bacto Tripton、0. 5%酵母提取物、NaCl和1. 5%琼脂)以形成 集落。从形成白色集落的转化菌株提取的重组质粒称为pUC118-tal。图5概述了该操作。随后，通过PCR扩增转酮醇酶基因。基于已知的转酮醇酶基因的核苷酸序列 (J. Bacteriol.，第174卷，1707-1708，1992)合成表5中显示的2种类型的引物。表 5TKT 引物TKT1(SEQ ID NO 17)CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAATKT2(SEQ ID NO 18)CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC对于第一 PCR，将从大肠杆菌细胞制备的基因组DNA用作模板，使用引物TKT1和 TKT2扩增大约2. lkbp的DNA片段，所述DNA片段包含在转酮醇酶基因的N末端的上游添 加的Xbal限制性切割位点和在转酮醇酶基因的C末端的下游添加的Xhol限制性切割位 点。在将该DNA片段的两个末端经历平端化反应后，将DNA片段与用HincII限制性内切酶切割的用于大肠杆菌的载体质粒DNA PUC118的片段混合，然后用T4连接酶连接以产 生重组质粒DNA。根据常规方法将所产生的重组质粒用于转化大肠杆菌JM109，然后将转 化菌株用于含有50 μ g/mL氨苄青霉素、0. ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷和20 μ g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基- β -D-半乳糖吡喃糖苷的LB平板培养基(1 % Bacto Tripton, 0.5%酵母提取物、NaCl和1.5%琼脂)以形成集落。从形成白色集落的转化菌株提取 的重组质粒称为pUC118-tkt。表6概述了该操作。然后，产生含有其中连接GAP启动子基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因的DNA片 段的重组质粒。即，将通过在XbaI限制性切割位点和SphI限制性切割位点(所述两个限 制性切割位点存在于转醛醇酶基因的C末端的下游区域中)上切割重组质粒pUC118-tal 获得的DNA片段与含有通过用XbaI和SphI切割重组质粒pUC118_tkt制备的转酮醇酶基 因的大约2. Ikbp的DNA片段混合，然后用T4连接酶连接来产生重组质粒DNA。根据常规方 法将所产生的重组质粒用于转化大肠杆菌JM109，然后将转化菌株用于含有50 μ g/mL氨苄 青霉素的LB平板培养基(1% Bacto Tripton,0. 5%酵母提取物、NaCl和1. 5%琼脂) 以形成集落。已确认，从形成集落的转化菌株提取的重组质粒具有以该顺序串连的Eno启 动子基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因，并且该重组质粒被称为pUC118-tal+tkt。图7概述了该操作。(3)pZA22_xy 的构建为了将木糖代谢系统的4种酶的基因导入运动发酵单胞菌并且在其中表达它 们，将这些基因插入穿梭载体以产生重组质粒。通过用XhoI限制性内切酶切割重组质粒 pUC118-taltkt来产生含有Eno启动子基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因的大约3. 3kbp 的DNA片段。将该片段与用限制性内切酶SalI切割的穿梭载体pZA22混合，然后用T4连 接酶连接以产生重组质粒。根据常规方法将所产生的重组质粒用于转化大肠杆菌JM109，然 后将转化菌株用于含有50 μ g/mL氯霉素的LB平板培养基(l^Bacto TriptoruO. 5%酵母 提取物、NaCl和1.5%琼脂)以形成集落。已确认，从形成集落的转化菌株提取的重组 质粒具有以该顺序串连的Eno启动子基因、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。在另一方面，通 过用EcoRI限制性内切酶切割pUCllS-xylAxylB以切出大约3. 4kbp的DNA片段(该片段 含有Gap启动子基因、木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因)，然后将两个切割末端平端化来 制备DNA片段。然后，将制备的DNA片段与通过用EcoRV限制性内切酶切割pZA22重组质 粒(所述重组质粒是通过插入转醛醇酶基因和转酮醇酶基因而制备的)获得的产物混合， 然后用T4连接酶连接以产生重组DNA质粒。根据常规方法将所产生的重组质粒用于转化 大肠杆菌JM109，然后将转化菌株用于含有50 μ g/mL氯霉素的LB平板培养基(1 % Bacto TriptoruO. 5%酵母提取物、NaCl和1.5%琼脂)以形成集落。已确认，从形成集落的 转化菌株提取的重组质粒具有以该顺序串连的GAP启动子、木糖异构酶、木酮糖激酶基因、 Eno启动子、转醛醇酶基因和转酮醇酶基因，并且该重组质粒被称为pZA22-xt。图8概述了该操作。(4)为运动发酵单胞菌提供木糖发酵能力将具有串联插入质粒pZA22的xylAB和taltktA基因的重组质粒pZA22_xt用于 研究具有木糖发酵能力的菌株的培育。
操作如下。按照常规方法将重组质粒pZA22_xt用于转化运动发酵单胞菌 IF013756，通过用于葡萄糖-RM平板培养基(2%葡萄糖、1. 0%酵母提取物、0. 2% KH2P04、 1.5%琼脂和10(^8/!^氯霉素，？!1 6.0)来选择转化菌株。将形成集落的转化菌株接种入 木糖-RM培养基(2%木糖、1.0%酵母提取物、0.2^KH2PO4和100 μ g/mL氯霉素，pH 6.0) 以研究其基于木糖作为碳源的生长和用于乙醇生产的发酵能力。然而，转化菌株在木糖-RM 培养基中只展示微弱的生长，并且未展示用于生产乙醇的发酵能力。然后，将上述Zm ms选 择为宿主菌株并且用pZA22-xt转化以获得Zm ms[pZA22-xt]菌株。将在葡萄糖-RM平板 培养基中生长的ZM ms[pZA22-xt]菌株接种入木糖-RM培养基以研究其基于木糖作为碳源 的生长和用于生产乙醇的发酵能力。作为结果，确认Zm ms[pZA22-xt]菌株以木糖作为碳 源为基础生长。在4%的木糖培养基中进行ZM ms[pZA22-xt]菌株的发酵检测。作为对照， 将通过将pZA22-xt导入野生型菌株获得的菌株(ZM[pZA22-xt])经历发酵测试。ZM ms[pZA22-xt]菌株以理论产率在48小时内完全利用4%木糖来生产乙醇。在另一个方面， 在ZM[pZA22-xt]菌株中，观察到由于微弱生长而导致的只有一部分木糖的降解，然而未发 现用于生产乙醇的发酵能力(图9)。实施例3为细菌菌株提供葡萄糖、甘露糖和木糖的同时发酵能力已通过将manA整合入运动发酵单胞菌的染色体DNA成功地将甘露糖和葡萄糖的 同时发酵能力提供给运动发酵单胞菌。然后，进行进一步的研究以提供木糖同时发酵能力。(1)同时具有大肠杆菌来源的木糖代谢系统和甘露糖代谢系统的基因的菌株的构
建制备实施例1中获得的已将manA整合入染色体的ZMms[E2 :manA]的感受态细胞， 用pZA22-xt转化细胞(图10)。基于木糖平板培养基上集落的形成选择转化菌株。然后， 监控获得的集落在含有木糖和甘露糖作为碳源的液体培养基中的生长。选择在木糖和甘露 糖的碳源中展示高度生长的转化菌株并且用于发酵测试。(2)培育的菌株中木糖代谢系统和甘露糖代谢系统的基因的表达研究共存于将要用于发酵测试的菌株中的木糖代谢系统和甘露糖代谢的基因的 表达。虽然在野生型运动发酵单胞菌菌株中发现内源果糖激酶活性，但未在其中发现木糖 异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和磷酸甘露糖异构酶的酶促活性。然而，在ZM ms[E2: :manA] 菌株中确认了磷酸甘露糖异构酶活性的表达，并且在Zm ms[pZA22-xt]中确认了作为导入 的木糖代谢系统的基因的表达指示的木酮糖激酶和转醛醇酶活性的表达。此外，在共表达 菌株中确认了木糖代谢系统的基因和manA基因的表达，还确认了与大肠杆菌相比较，这些 基因的表达水平在此类菌株中更高。即，确认了导入的基因是稳定的并且高效地表达。表6显示导入的基因表达的确认结果。表6 注释1)XK 木酮糖激酶，1U =在1分钟内减少1 P mol NADH的酶促活性。TA 转醛醇酶，1U =在1分钟内减少1 P mol NADH的酶促活性。PMI 磷酸甘露糖异构酶，1U =在1分钟内减少1 P mol NADH的酶促活性。(3) 3种糖的混合糖的发酵测试(在分批类型发酵的条件下)通过使用其中已将manA导入染色体并且将XylA、XylB、tal和tktA作为质粒导入 的培育的菌株估计发酵能力。如图11a和图lib中所示，当将2%葡萄糖、木糖或甘露糖用 作唯一碳源时，与葡萄糖的发酵率相比较，看到轻微的减少，但该菌株展示与木糖和甘露糖 的快速消耗和以理论产率进行的乙醇产生相一致的生长。菌株对于与葡萄糖共存的木糖或 甘露糖还展示快速的乙醇产生。至于在葡萄糖、木糖和甘露糖共存的情况下糖的消耗，以这 样的顺序发生，即首先消耗葡萄糖，然后消耗木糖和甘露糖。从而，看到理论产率的乙醇产 生。如上所述，已成功地培育了能够高效地将酸处理糖化溶液中含有的主要糖类葡萄 糖、木糖和甘露糖转化成乙醇的运动发酵单胞菌菌株。培育的菌株称为ZM mX42，并且自2007年8月13日以来一直由日本产业技术总
合研究所国际专利生物保藏所，tsukuba Central 6，l-l-lHigashi，Tsukuba 305-8566，
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Japan在布达佩斯条约的条款下于登录号〖FERM BP-11025下保藏。j实施例4废木料的酸处理糖化溶液的发酵测试(在分批类型发酵的条件下)通过使用废木 料的酸处理糖化溶液进行培育的菌株(ZMmS42[SuCZE2::manA，pZA22-xt])的发酵测试。将 按照常规方法(AppliedBiochemistry and Biotechnology，第 98-100 卷，899-807，2002) 制备的施工废弃物的浓硫酸处理的糖化溶液用作废木料的酸处理糖化溶液。在将1倍体积的2倍浓度的RM培养基(2%的碳源、的酵母提取物和0. 2% ofKH2P04,pH6. 0-6. 5)加入至1倍体积的酸处理糖化溶液的情况下或在将1倍体积的10倍 浓度的冊培养基加入至9倍体积的酸处理糖化溶液的情况下进行发酵测试。结果示于图12a和图12b中。根据图12a，消耗葡萄糖、甘露糖和木糖，以接近理论 产率的产率生产乙醇。在几乎为未稀释溶液的酸处理糖化溶液的情况下，如图12b中所示， ZM ms[pZA22-xt]也快速地发酵3种类型的糖，以高产率生产乙醇。实施例5生物乙醇产生反应器(1)附着的固定化细菌细胞培养物和反应器的制备
下面举例说明附着的固定化细菌细胞培养物的制备和用于发酵的充填有细菌细 胞的反应器的产生。(a)酸处理糖化溶液培养基的制备1)用CaCO3将酸处理糖化溶液(大约pHl. 0)中和至接近pH5. 5。2)通过抽滤(suction filtration)从中和的酸处理糖化溶液除去沉淀，将溶液 在4°C下贮存。3)将酸处理糖化溶液在80°C下进行巴氏灭菌，进行1天或更长时间，同时沉积过
量的沉淀。4)为了用作用于连续发酵测试和发酵测试的培养基，以2倍、2. 5倍和10倍的浓 度制备不含碳源的RM培养基和T-培养基，将每一种培养基与经巴氏灭菌的酸处理糖化溶 液混合。通过离心(25°C，8000rpm，60分钟)除去任何形成的沉淀。T-培养基是具有2%的碳源、的酵母提取物、的KH2PO4、0. 2%的(NH4)2SO4和 0. 05%的MgSO4 · 7Η20(ρΗ6· 0)的组成的培养基。(b)附着的固定化细菌细胞培养物的制备1)为了进行大规模培养，向500ml补充有合适的糖的RM培养基(T_培养基)中加 入表7中所示的载体，对混合物进行高压灭菌。表 7 2)在将混合物冷却至室温后，将细菌细胞接种入该培养基中，然后将其在30°C下 经历静止培养，进行2天或更长时间。此时，将使细菌细胞附着至其上的载体用作固定化细 胞。(d)使用反应器的连续发酵测试用70%的固定化细菌细胞培养物充填柱子，将流体浴类型(fluidbath type)反 应器用于上行法(ascending method)。图13和表8分别显示了反应器的示意图和用于连续发酵的条件。表8 (c)用于分析发酵溶液的方法糖和乙醇通过使用来自按时间取样的反应器的洗脱物来分析乙醇的产生和糖组分的减少。 即，将ImL柱提取物离心(4°C，15000rpm, 15分钟)，然后通过HPLC进行分析。 HPLC分析条件如下。条件下1使用的柱子BIO-RADAminex HPX-87P流速0.4mL/ 分钟柱子温度80°C提取液脱气蒸馏水样品量5yL条件2使用的柱子ShodexSUGAR KS-801流速0.5mL/分钟柱子温度50°C提取液脱气蒸馏水样品量5yL根据下列反应方案测定乙醇的产率。葡萄糖+ADP+Pi — 2 乙醇 +2C02+ATP3 木糖 +3ADP+3Pi — 5 乙醇 +5C02+3ATP理论乙醇产率=0. 51%乙醇葡萄糖或木糖实施例6废木料的酸处理糖化溶液的连续发酵(1)模型酸处理糖化溶液的连续发酵将充填有实施例5中描述的重组单胞发酵菌的固定细菌细胞培养物的反应器用 于评估用于从含有葡萄糖、甘露糖和木糖(作为混合物)的模型糖溶液生产乙醇的连续发 酵。首先，使用6%葡萄糖+2%甘露糖+2%木糖的模型糖溶液在30°C和pH6. 5下于充填有 ZM ms42[sucZE2: :manA, pza22-xyl]的反应器中进行连续发酵测试，D = 0. 2/小时。作为 结果，如图14中所示，观察到理论产率的乙醇产量，其相应于葡萄糖和甘露糖的完全消耗。 然而，看到木糖作为残留的糖存在于发酵溶液中，从而发现三种类型的糖的连续同时发酵 非常困难。因此，研究木糖的降低的发酵能力的原因，发现发酵溶液影响木糖的发酵能力。 图15显示通过观察培育的菌株的糖的发酵能力与发酵溶液的初始pH之间的相互关系获得 的结果。在ZM ms42[sucZE2: :manA，pza22-xyl]的情况下，未看出初始pH对葡萄糖和甘露 糖的发酵的影响，然而发现糖溶液的初始PH显著影响木糖发酵能力。即，在pH5或更低的 PH下观察到木糖发酵能力的降低。这些结果表明pH控制在混合糖溶液的连续发酵中是必 需的。(2)废木料的酸处理糖化溶液的连续发酵稀释的酸处理糖化溶液的连续乙醇产生按照上述附着固定法进行ZM ms42[sucZE2::manA, pza22-xyl]的固定化细菌细胞培养物的制备，用细菌细胞充填柱子(内径25mm，长度130mm)，同时防止气泡进入。然 后，如上所述制备1 1的酸处理糖化溶液-RM培养基(PH6. 5)，在30°C下使用该培养基以 16mL/小时的流速和D = O. 25/小时在恒温器中进行连续发酵。结果示于图16a中。如从这些结果所显示的，虽然甘露糖在发酵开始时保持为残留的糖，但最终几乎 不存在残留的糖。平均乙醇浓度为1.97%，产率为88. 79%，乙醇形成速度为5. 18g/L ·小 时。由此，以接近理论产率的产率获得乙醇的产生。因而，除了增加糖浓度外，按照相同的方式进行连续发酵测试。如从图16b的结果 所看到的，不存在残留的糖，平均乙醇浓度为2. 45 %，此时产率为96. 16 %，乙醇形成速度 为6. 24g/L ·小时。由此，以理论产率生产乙醇。(3)从酸处理糖化溶液进行的连续乙醇产生上述结果清楚地显示可能通过施工废弃物的酸处理糖化溶液的连续发酵生产乙 醇。因此，通过实际测试来研究从酸处理糖化溶液进行的连续乙醇产生。S卩，在16mL/小时的流速、D = O. 25/小时和30°C的条件下在接近未稀释的溶液 (10 1)的浓度上进行连续发酵测试。作为结果，存在更少的残留的糖，并且以理论产率 生产乙醇。平均乙醇浓度为3. 73%，产率为92. 20%，乙醇形成的速度为10. 27g/L ·小时 (图17a)。此外，为了研究用于生产乙醇的高速连续发酵，通过以32ml/小时的流速和D = 0. 50/小时维持酸处理糖化溶液的上述糖浓度在30°C下于恒温器中进行连续发酵。作为结 果，葡萄糖和木糖被消耗，只有痕量甘露糖残留。平均乙醇浓度为3. 83%，产率为86. 56%, 乙醇形成的速度为20. 88g/L ·小时(图17b)。由此，以接近理论产率的产率生产乙醇，即 使种稀释率为0. 50/小时亦如此。工业适用性 如上所论述的，根据本发明，可通过使用能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发 酵细菌菌株建立节能高效的生物乙醇转化方法，所述发酵细菌菌株可通过发酵纤维素类型 和木质纤维素类型的生物质源来生产乙醇。序列表自由正文SEQ ID NO=I 扩增编码大肠杆菌manA的DNA的经设计的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 2 扩增编码大肠杆菌manA的DNA的经设计的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 3 扩增编码大肠杆菌manA的DNA的经设计的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 4 扩增编码大肠杆菌manA的DNA的经设计的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 5 扩增编码运动发酵单胞菌基因组E2基因部分的DNA的经设计的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 6 扩增编码运动发酵单胞菌基因组E2基因部分的DNA的经设计的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 7 扩增编码运动发酵单胞菌基因组E2基因部分的DNA的经设计的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 8 扩增编码运动发酵单胞菌基因组E2基因部分的DNA的经设计的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 9 扩增编码大肠杆菌xylA、B的DNA的经设计的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 10 扩增编码大肠杆菌xylA、B的DNA的经设计的寡核苷酸引物；
SEQIDNO11扩增编码大肠杆菌xylA、B的DNA的经设计的寡核苷酸引物
SEQIDNO12扩增编码大肠杆菌xylA、B的DNA的经设计的寡核苷酸引物
SEQIDNO13扩增编码大肠杆菌tal的DNA的经设计的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO14扩增编码大肠杆菌tal的DNA的经设计的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO15扩增编码大肠杆菌tal的DNA的经设计的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO16扩增编码大肠杆菌tal的DNA的经设计的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO17扩增编码大肠杆菌tkt的DNA的经设计的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO18扩增编码大肠杆菌tkt的DNA的经设计的3S核苷酉1引物。
权利要求
能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发酵细菌，其为包含按照同源重组方法通过双交换而被整合入位于染色体上的蔗糖6-果糖基转移酶基因的编码大肠杆菌来源的磷酸甘露糖异构酶的基因和导入的重组DNA的运动发酵单胞菌，所述导入的重组DNA是通过将包含全部都为大肠杆菌来源的分别编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因的DNA片段连接至载体形成的。
2.权利要求1的发酵细菌，其可通过使用高蔗糖6-果糖基转移酶产生性菌株作为宿主 菌株而获得。
3.权利要求2的发酵细菌，其中所述宿主菌株为运动发酵单胞菌ZMcs(FERM BP-I1024)。
4.权利要求3的发酵细菌，其为运动发酵单胞菌ZMmx42(FERMBP-11025)。
5.用于生产乙醇的方法，其包括使纤维素类型和/或木质纤维素类型生物质源的糖化 溶液与已被固定在固定化载体上的权利要求1的能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的发 酵细菌彼此接触，从而发酵糖化溶液以获得发酵溶液，以及从发酵溶液回收乙醇。
6.权利要求5的用于生产乙醇的方法，其中所述发酵细菌是运动发酵单胞菌ZM mx42(FERM BP-I1025)。
7.权利要求5的用于生产乙醇的方法，其中所述生物质源是木质生物质源。
8.权利要求5的用于生产乙醇的方法，其中将所述糖化溶液连续地进料入充填有固定 化发酵细菌的反应器，从而使糖化溶液和发酵细菌彼此接触，以获得发酵溶液，连续地收集 发酵溶液，以及从其回收乙醇。
全文摘要
目的是开发能够同时发酵葡萄糖、甘露糖和木糖的细菌，其可发酵纤维素类型或木质纤维素类型的生物质源的糖化溶液以生产乙醇，和构建节能高效的生物乙醇转化方法。因此，公开了运动发酵单胞菌，该细菌是通过将来源于大肠杆菌的编码磷酸甘露糖异构酶的基因整合入(利用同源重组方法，通过双交换)位于染色体上的蔗糖6-果糖基转移酶基因，然后导入通过将含有分别编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的基因(全都来源于大肠杆菌)的DNA片段连接至载体制备的重组DNA制备的。还公开了用于通过在系统(将运动发酵单胞菌细菌固定在所述系统上)中连续发酵纤维素类型生物质源的糖化溶液来生产乙醇的方法。
文档编号C12P7/08GK101889078SQ20088011945
公开日2010年11月17日 申请日期2008年10月3日 优先权日2007年10月5日
发明者冈本贤治, 簗濑英司 申请人:国立大学法人鸟取大学