专利名称：使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生的制作方法
使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生
相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年10月5日提交的美国临时专利申请号60/977775的优先权， 在此通过引用并入其整体内容。技术领域
本发明概括地涉及基于细胞的疗法领域。更具体而言，本发明涉及脐带组织来源 的细胞在修复和再生患病的或受损伤的肾脏中的用途。技术背景
本说明书通篇引用了多种出版物，包括专利、公开的申请、技术文章和学术文章。 在此通过引用并入所有这些所引用的出版物整体，并用于多种目的。
肾脏疾病是一种严重的、医疗条件不能满足的疾病，每年美国的花费负担超过270 亿美元。目前，超过4000万美国人濒临肾脏疾病的风险或患有肾脏疾病，且其发病率正以 每年6%的令人担忧的速率增加。因此，到2020年，估计每四个人中就有一人将患有需要透 析或肾脏移植的晚期肾脏疾病(ESRD)。为了减轻这些经济上的和医疗上的挑战，用于治疗 急性肾功能衰竭(ARF)和慢性肾脏疾病(CKD)两种疾病的新颖的、转化的技术是必需的。
急性肾功能衰竭，也称作急性肾小管坏死，是一种影响高达7%的所有住院患者的 常见综合征(Kelly et al. (2000) Semin. Nephrol. 1 :4-19) 0 ARF是肾脏排泄废物、浓缩尿 液和保存电解质能力的突然丧失。ARF最常发生在个体被暴露于对肾脏有害的药物或缺 血-再灌注事件之后。其他原因包括感染、尿路梗阻和某些血液和自身免疫紊乱。这些损 害引起对肾脏的功能组件一肾单位的损伤。更具体而言，近端小管细胞变成坏死的。然后 所述小管细胞从肾小管基底膜脱离，阻塞肾小管管腔。这种阻塞导致肾小管内压的增加，引 起滤液从肾单位渗漏进入周围肾实质。肾单位功能的降低和肾脏组织中滤液的累积导致肾 小球滤过率的降低，最终发生肾衰竭。尽管ARF是严重的、威胁生病的紊乱，但它是可逆的。
已经提出了几种治疗方法，目的在于减少或消除ARF。最值得注意的是，先进的透 析技术被频繁地使用。尽管如此，经透析治疗的ARF患者中的死亡率仍然保持30-80 %， 表明透析在治疗ARF中具有小的治疗价值(Morigi et al. (2004) J. Am. Soc. Nephrol. 15 1794-804)。此外，基于药理学的疗法诸如多巴胺、furosmide、甘露醇或心房钠尿肽给药在 临床研究中已经失败了(Haug et al. (1993)Transplantation 55 :766-772 ；Lieberthal andNigam(2000)Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278 :F1_F12)。这些数据表明，传统的策略 对开发ARF疗法而言是不充分的，必须应用新理论。
ARF之后肾功能的恢复取决于坏死的肾小管细胞被有功能性肾小管上皮的替换。 损伤之后，肾小管能够自我修复，形成新的近端小管细胞以替换失败的或坏死的细胞。产生 新肾小管细胞的祖细胞的起源是未知的。
然而，有可能的是，肾小管再生遵循所述的干细胞/短暂扩增细胞范例用于更快 速的再生器官系统。
最近的研究已经证实，骨髓来源的间质干细胞(MSCs)是向肾的，并帮助修复药 物和缺血引起的ARF之后的肾脏(Morigigi et al. 2004)。最近也已经显示，对患有缺 血/再灌注损伤的每只大鼠颈内动脉给药IXlOfiMSCs导致显著改善的肾功能(Togel et al. (2005) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 289(1) :F31_42)。进一步显示，MSCs 的保护作用 是不依赖干细胞分化的，反而其保护作用是保护肾脏的营养因子分泌的结果。
不同于ARF，慢性肾脏疾病(CKD)是肾脏功能逐步的和渐进的损失。它通常是不可 逆的，并最终导致晚期肾脏疾病。在美国，CKD正在变得日益常见，并且它是与不幸的健康 结果和高的医疗费用相关的。国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)估计2000 万美国人患有CKD，并且至少另外的2000万人处于发展CKD的风险之中。如果不进行治疗， CKD可导致显著的贫血、电解质失衡、骨病、心血管疾病和肾功能衰竭的发病率和死亡率。
渐进的肾脏疾病起因于最初的疾病损失(例如，高血压)、随后对该损伤的不适合 的肾脏响应的组合。所述响应包括促炎症反应和促纤维化的细胞因子和生长因子的产生。 因此，减缓CKD进程的一种策略是改善炎症性和纤维化响应以及修复或逆转现存的肾脏损 伤。已经表明了，生长因子给药可减缓CKD进程。例如，骨变形蛋白-7(BMP-7)在患有单向 输尿管梗阻的大鼠中预防肾小管萎缩、间质性炎症和纤维化。相似地，BMP-7给药在狼疮性 肾炎的MRL lpr/lpr小鼠模型中减少肾小管间质性纤维化和肾小球硬化。此外，已经表明 肝细胞生长因子在多种肾脏损伤的动物模型中具有潜在的抗炎和抗纤维化效能。已经表现 出治疗前途的其他因子包括转化生长因子-β 1、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长 因子、成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)、白介素、肿瘤坏死因子和单核细胞趋化蛋白-1。这 些研究均证实，生长因子给药对CKD的预防治疗而言是有前途的治疗方法。
尽管现存的医疗治疗选项，死亡率仍然非常高，并且肾脏疾病的发病率仍在上升。 因此，本领域存在改善的、潜在的治愈性疗法的需要。现在，没有治疗介入试图使肾脏疾病 的进程停止或甚至逆转。本发明提供表现极大的肾脏保护前途的治疗方法，它促进内源性 肾脏再生、替换坏死的肾脏细胞并最终防止ESRD。
发明概述
根据一个方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方 法。例如，对肾脏的损伤可包括由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、射线暴露、氧化、免疫复 合物沉积或移植排斥引起的损伤。所述方法包括为所述患者给药治疗疾病或损伤有效量的 脐带组织来源的细胞。从中获得所述细胞的脐带组织优选为基本没有血的。所述脐带组织 来源的细胞优选能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能，例如分化成肾脏表型； 需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表达α平 滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达氧化水平增加的 低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白(reticulorOl。在一些实施方式中，所述脐带组 织来源的细胞表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋化因子受体配体3、和/或粒细胞 趋化蛋白2。在优选的方面，所述脐带组织来源的细胞表达⑶10、⑶13、⑶44、⑶73和⑶90。 在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞在给药患者之前，在体外被诱导分化成肾谱 系细胞。所述脐带组织来源的细胞可通过遗传工程表达促进肾脏组织修复和/或再生的基 因产物。在本发明的一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞是与至少一种其他细胞类 型一起给药的，所述其他细胞类型包括但不限于近端小管上皮细胞、享勒袢上皮细胞、远端5小管细胞、集合管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球膜细胞、血管内皮细胞、间质 细胞(intersticial cell)或其他多能的或多能干细胞。所述至少一种其他细胞类型可与 所述脐带组织来源的细胞同时、或其之前、或其之后给药。在本发明的一些方面，所述脐带 组织来源的细胞是与至少一种药物一起给药的。所述药物可与所述脐带组织来源的细胞给 药的同时、其之前或其之后给药。在本发明的一些优选方面，所述脐带组织来源的细胞对患 者的肾脏发挥营养作用。根据本发明的一些方面，所述细胞可通过注射或输注给药。在一 些实施方式中，可将所述细胞封装于可植入装置中给药。在本发明的一些实施方式中，所述 细胞可通过植入包括所述细胞的装置给药。
根据本发明的另一方面，本发明提供了治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的 方法，其包括为所述患者给药包括可溶性细胞碎片、裂解物、细胞外基质或从脐带组织来源 的细胞制备的条件培养基的组合物，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能 够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5% 氧气中生长；不产生CD117或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间 质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白 1。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物 组合物，所述组合物包括药学上可接受的载体和治疗所述疾病或损伤有效量的脐带组织 来源的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和 扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生 CDl 17或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨 髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。在一些实施方式 中，对肾脏的损伤可由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、射线暴露、氧化、免疫复合物沉积或 移植排斥引起。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞在所述组合物制成制剂之前， 在体外被诱导分化成肾谱系细胞。在一些实施方式中，所述脐带组织来源的细胞通过遗传 工程表达促进肾脏组织修复和/或再生的基因产物。在一些实施方式中，所述药物组合物 包括至少一种其他细胞类型。所述至少一种其他细胞类型可为但不限于近端小管上皮细 胞、享勒袢上皮细胞、远端小管细胞、集合管细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾小球膜 细胞、血管内皮细胞、间质细胞或其他多能的或多能干细胞。在一些优选实施方式中，所述 药物组合物进一步包括至少一种药物。在一些优选实施方式中，所述药物组合物被制成用 于注射或输注给药的剂型。在本发明所述药物组合物的一些优选实施方式中，可将所述脐 带组织来源的细胞封装于可植入装置中。在本发明所述药物组合物的一些优选实施方式 中，所述细胞被接种于基质中。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物 组合物，其包括药学上可接受的载体和裂解物、细胞外基质或从脐带组织来源的细胞制备 的条件培养基，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新 和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生 CDl 17或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨 髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
根据另一方面，本发明提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括药学上可接受的载体、治疗所述疾病或损伤有效量的脐带组织来源的细胞，其中 所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化 的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表 达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增 加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗至少一个肾脏患病或受 损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。在一些实施方式中，所述试剂盒包括用于培 养所述细胞的至少一种试剂和指导。在一些实施方式中，所述试剂盒包括至少一种其他细 胞类型的群。在一些实施方式中，所述试剂盒包括至少一种药物。
本发明同样提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括 药学上可接受的载体、裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的脐带组织来源的细胞 制备的条件培养基，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我 更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不 产生CDl 17或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂 嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗 至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指导。
本发明的前述和其他特征和优点将从下面的、本发明优选实施方式的更具体描述 中变得明白，如在附图中图解说明的。
附图简述
图1显示执行肾脏损伤和修复实验的时间线。黑箭头指示注射顺钼、细胞或HBSS 溶媒的时间，以及抽血和尸检发生的时间。
图2显示诱导肾脏损伤和脐带组织来源的细胞移植后的动物存活率。治疗组动物 数显示在X-轴上。
图3显示小鼠的BUN测量。在细胞移植后的第1、3、5和7天时收集血清样品并测 量BUN。误差棒代表SEM。
图4显示来自血清肌酸酐测量的结果。误差棒代表平均值的标准误差。OP<0. 03。
图5显示代表性的组织学图像。根据肾小管变性程度对组织切片打分A)溶媒治 疗组。B)hUTC(0.2e6细胞剂量)治疗组。代表性的肾小管具有显著的变性。
图6显示大鼠的BUN分析。误差棒代表平均值的标准误差。 值< 0. 005。*p值<0. 03。
图7显示大鼠的SCr分析。误差棒代表平均值的标准误差。值< 0. 005。*p值<0. 03。
图8显示大鼠的CrCl分析。误差棒代表平均值的标准误差。、值< 0. 03。
发明详述
本说明书和权利要求书通篇使用了涉及本发明的方法和其他方面的多种术语。除 另有说明外，所述术语是以它们在本领域的普通含义给出的。其他特别定义的术语将以与 在此提供的定义一致的方式进行解释。
如说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括 复数指示物，除非内容给出了清楚的指示。因此，例如，提到“细胞”包括两个或更多细胞的 口，寸寸。
在此所用的术语“约”，当指测量数值诸如量、短暂的持续时间等时，意味着包 括偏离指定数值的士20%或士 10%的变异，更优选士5%，甚至更优选士 1%，还更优选 士 0. 1%，像这样的变异适合于进行本公开的方法。
所用“来源的”是指已经从它们的生物来源获得并在培养中生长、扩增，永生的，或 以其他方式在体外操作的细胞。
“经分离的”是指“通过人工”从天然状态改变的。如果分子或组合物是天然存在 的，如果它已经改变了或远离了它的原始环境，或者两种情况均存在，则它已经“经分离” 了。
术语核酸分子或基因的“表达” “表达了”或“表达”是指基因产物的生物合成，例 如，多肽的生物合成。
“营养因子”是促进细胞存活、生长、分化、增殖和/或成熟、或刺激细胞增加的生物 活性的物质。
“损伤”是指对肾脏的任何身体伤害、损害、变性或创伤。
“病理学”是指细胞、组织、器官或系统偏离正常状态的任何结构的或功能的标记， 如通过适合于本领域的任何方法所测量的。
“疾病”是指细胞、组织、器官、系统或生物体整体在健康、状态或功能方面的任何 偏离或病损。
肾脏的“原发病”是指起源于肾脏，以肾脏为专有靶标、基本专有靶标或基本靶标 的任何疾病。
肾脏的“继发病”是指肾脏不是原发病的任何疾病。经由实例但不是限制性的，所 述疾病可能以肾脏为非专有靶标、偶然靶标，扩散于肾脏或以别的方式影响肾脏。该术语包 括源于感染或身体其他器官或系统疾病的肾脏疾病，或源于引起、支持或增强肾脏病理学 的全身性疾病的肾脏疾病。
“肾脏”是指或涉及一个或更多肾脏。
“治疗”是指在疾病、损伤或状况的弱化或改善方面的任何成功或成功的标记，包 括任何客观的或主观的参数诸如症状的减轻、缓和、减少，或使得疾病、损伤或状态对患者 而言更能耐受，减缓恶化或衰弱的速率，使得恶化的终点更衰弱，改善受试者的身体或精神 的健康，或延长存活的长度。症状的治疗或改善可基于客观的或主观的参数；包括体检的结 果、神经系统检查和/或精神病学评价。
“有效量”或“治疗有效量”在此可互换使用，并是指在此所述的化合物、材料或组 合物对达到特定的生物学结果有效的量，所述特定的生物学结果诸如，但不限于，在此公开 的、描述的或举例说明的生物学结果。所述结果可包括，但不限于，受试者中肾脏疾病或损 伤的治疗，如通过适合于本领域的任何方法所测量的。
“药学上可接受的”是指从药理学/毒理学角度能够为患者所接受以及从关于组合 物、处方、稳定性、患者的接受性和生物利用度的物理/化学角度能够为制药化学家所接受 的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分生物活性的有效性并 且对给药的宿主没有毒性的媒介。
根据本发明已经发现，受损的肾脏可通过给药脐带组织来源的细胞而得以修复和8再生，从而逆转急性肾功能衰竭并增强已经患有肾脏损害的动物存活。也已经进一步地发 现了，将所述细胞给药所述动物将受损害动物的血尿素氮和血清肌酸酐水平正常化。相应 地，本发明描述了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的受试者的方法的特征。一般而言， 所述方法包括将治疗有效量的脐带组织来源的细胞给药所述受试者，从而发生受折磨的肾 脏的修复和/或再生。
哺乳动物的脐带可在足月妊娠或早产妊娠的终点时或终点之后立刻回收，例如在 分娩娩出或剖宫产术手术移除之后。在细胞分离之前，除去脐带组织中的血和碎片，例如通 过采用任何适宜的媒介或缓冲液清洗。
可通过机械力或通过酶消化将细胞从脐带组织中分离出来。优选的酶是金属蛋白 酶、中性蛋白酶和粘液溶解性蛋白酶。例如，可使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的多种组 合以将细胞从脐带组织分离出来。技术人员将理解，用于从多种组织来源分离细胞的许多 这样的酶处理在本领域是已知的。例如，LIBERASE Blendzyme (Roche)系列的酶组合 适用于本方法。酶的其他来源是已知的，技术人员也可直接从它们的天然来源获得这样的 酶。技术人员也是充分装备的以获得新的或另外的酶或酶组合，为了它们在分离本发明细 胞中的效用。优选的酶处理是0. 5、1、1. 5或2小时或更长时间。
经分离的细胞可被用于开始细胞培养。将经分离的细胞转移至无菌的组织培养 容器中，不覆盖或覆盖有细胞外基质或配体诸如层粘连蛋白、胶原(天然的、变性的或交联 的)、明胶、纤连蛋白和其他细胞外基质蛋白质。将脐带组织来源的细胞培养于能够维持 所述细胞生长的任何培养基中，所述培养基诸如，但不限于，DMEM(高或低葡萄糖)、高级 DMEM、DMEM/MCDB 201、Eagle' s基础培养基、Ham，s FlO培养基(FlO)、Ham' s F-12培养基 (F12) ,Hayglick培养基、Iscove改良的达尔贝科培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、 DMEM/F12、RPMI 1640 和 CELL-GRO-FREE。
所述培养基可采用一种或更多组分进行补充，所述组分包括，例如胎牛血清 (fetal bovine serum)，优选约 2-15 % (ν/ν)；马血清；人血清；胎牛血清(fetalcalf serum) ； β -巯基乙醇，优选约0. 001 % (ν/ν)；一种或更多生长因子，例如，血小板来源 的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(TOF)、血管内皮生长 因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、白细胞抑制因子(LIF)和促红细胞生成素 (erythropoietin)；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及一种或更多抗生素和/或抗霉菌剂以控 制微生物污染，诸如，例如青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，单独使 用或组合使用。
将所述细胞以允许细胞生长的密度接种于培养容器中。在一个实施方式中，所述 细胞在空气中(X)2的体积百分数为约0至约5下培养。在一些实施方式中，所述细胞在空 气中A的百分数为约2至约25下培养，优选空气中&的百分数为约5至约20。所述细胞 优选在约25°C至约40°C下培养，更优选在37°C下培养。所述培养容器中的培养基可为静态 的或搅动的，例如使用生物反应器。脐带组织来源的细胞优选在低氧化性应激(例如，添加 有谷胱甘肽、维生素C、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸)下生长，意味着对所培养 的细胞没有或最小的游离基损伤。
可将脐带组织来源的细胞传代或移动至另外的培养容器中，所述另外的培养容器 含有与最初使用的相同或不同类型的新鲜培养基，在所述另外的培养容器中所述细胞群可进行有丝分裂扩增。本发明的所述细胞可在介于0代和衰老之间的任何点使用。优选将所 述细胞传代约3至约25次，更优选传代约4至约12次，并优选传代10或11次。可进行克 隆和/或亚克隆以证实已经分离得到细胞的克隆易群。
可将脐带组织中存在的不同细胞类型分为亚群。这可通过使用用于细胞分离的标 准技术来完成，所述标准技术包括，但不限于，酶处理；克隆和具体细胞类型的选择，例如但 不限于基于形态学和/或生化标记物的选择；所需细胞的选择性生长(阳性选择)，不需要 的细胞的选择性破坏(阴性选择)；基于在混合的细胞群中有差别的细胞可凝集性的分离， 例如，采用大豆凝集素；冻融程序；在混合的细胞群中有差别的细胞粘附性质；过滤；常规 的和区带离心法；离心冲洗(逆流离心)；单位重力分离；反流分布法；电泳；荧光激活细胞 分选术(FACS)；等。
从脐带组织中分离的细胞的实例于2004年6月10日保藏在theAmerican Type Culture Collection，并指定了如下的ATCC登录号(1)将菌株名称UMB 022803 (P7)指定 为登录号PTA-6067 ；以及(2)将菌株名称UMB 022803 (P17)指定为登录号PTA-6068。
脐带组织来源的细胞可通过如下途径来鉴定，例如，通过生长特性(例如，群体倍 增能力、倍增时间、传代至衰老)、核型分析(例如，正常核型、母源谱系或新生儿谱系)、流 式细胞术(例如，FACS分析)、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，用于检测表型)、 基因表达谱(例如，基因芯片阵列、聚合酶链反应(例如，逆转录酶PCR、实时PCR和常规 PCR))、蛋白质阵列、蛋白质分泌(例如，通过血浆凝固试验或PDC条件培养基的分析，例如 通过酶联免疫吸附试验(ELISA))、混合淋巴细胞反应(例如，作为PBMCs的刺激的测量)， 和/或本领域已知的其他方法。
在多个方面，所述脐带组织来源的细胞具有下列生长特征中的一个或更多在培 养物中需要L-缬氨酸用于生长，能够在含约5%至至少约20%的氧气的气氛中生长，在达 到衰老之前具有在培养物中至少倍增约40倍的潜能，并且在覆盖的或无覆盖的组织培养 瓶中粘附和扩增，其中所述覆盖的组织培养瓶包括明胶、层粘连蛋白、胶原、多鸟氨酸、玻连 蛋白或纤连蛋白。
在某些实施方式中，所述细胞具有正常核型，随着细胞的传代核型保持。核型分析 对鉴别和区分来自基于胎盘的母细胞的新生儿细胞是特别有用的。核型分析的方法是可用 的并且是本领域的技术人员已知的。
在其他实施方式中，所述细胞的特征可为某些蛋白质的产生，包括组织因子、波 形蛋白和α -平滑肌肌动蛋白中至少一种的产生，以及⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、 PDGFr- α、PD-L2和HLA-A、B、C细胞表面标记物中至少一种的产生，如通过流式细胞术检 测的。在其他实施方式中，所述细胞的特征可为缺乏⑶31、⑶34、⑶45、⑶80、⑶86、⑶117、 CD141、CD178、Β7-Η2、HLA-G 和 HLA-DR、HLA-DP 和 / 或 HLA-DQ 细胞表面标记物中至少一种 的产生，如通过任何适宜的方式诸如流式细胞术检测的。特别优选的是产生组织因子、波形 蛋白和α-平滑肌肌动蛋白中至少两种的细胞。更优选的是产生蛋白质组织因子、波形蛋 白和α-平滑肌肌动蛋白中所有三种的那些细胞。
在其他实施方式中，相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞的人细 胞，所述细胞具有编码白介素8、浆膜蛋白1、趋化因子(C-X-C基序)配体1(黑色素瘤 (melonoma)生长刺激活性，α )、趋化因子(C_X_C基序)配体6(粒细胞趋化蛋白2)、趋化因子(C-X-C基序)配体3、肿瘤坏死因子、α-诱导蛋白3、C-型凝集素超家族成员2、Wilms 瘤1、醛脱氢酶1家族成员A2、肾素、氧化低密度脂蛋白受体1、智人克隆IMAGE :4179671、蛋 白激酶C4、假设的蛋白质DKFZp564F013、卵巢癌中下调的1和来自克隆DKFZpM^dll3的 智人基因中至少一种的基因的增强的表达。
在另一些其他实施方式中，相对于作为成纤维细胞、间质干细胞或髂嵴骨髓细胞 的人细胞，所述细胞具有编码下列中至少一种的基因的减少的表达身材矮小症同源框2、 热休克27kDa蛋白2、趋化因子(C-X-C基序)配体12(间质细胞来源的因子1)、弹性蛋 白(瓣膜上主动脉狭窄，Williams-Beuren综合征)、智人mRNA、cDNA DKFZp586M2022 (来 自克隆DKFZp586M2022)、间充质同源域编码框2 (生长停止特异的同源域编码框)、sine oculis同源框同系物1(果蝇属)、晶状体蛋白、α B、形态发生的散乱的关联活化剂2、 DKFZP586BM20蛋白、类似于neural in 1、四连接素(纤溶酶原结合蛋白)、src同源三 (SH3)和半胱氨酸富集结构域、胆固醇25-羟化酶、runt-相关的转录因子3、白介素11受 体α、前胶原C-内肽酶增强子、翻毛同系物7 (果蝇属)、假设的基因BC008967、类型VIII α 1胶原、腱糖蛋白C(六聚臂蛋白)、依洛魁族人同源框蛋白5、亚铁氧化酶(h印haestin)、 整联蛋白β 8、突触囊泡糖蛋白2、神经母细胞瘤致瘤性1的抑制、胰岛素样生长因子结合蛋 白2(36kDa)、智人cDNA FLJ12280 fis克隆MAMMA1001744、细胞因子受体样因子1、钾中间 的/小的传导力钙-活化的传代亚家族N成员4、整联蛋白β 7、含PDZ-结合基序的转录辅 激活因子(TAZ)、Sine oculis同源框同系物2 (果蝇属)、KIAA1034蛋白、囊泡相关的膜蛋 白5(my0brevin)、含EGF的腓骨蛋白(fibulin)-样细胞外基质蛋白1、早期生长响应3、远 端较小的同源域编码框5、假设的蛋白FLJ20373、醛酮还原酶家族1成员C3 (3-α羟基固醇 脱氢酶类型II)、二聚糖、含PDZ结合基序的转录辅激活因子(TAZ)、纤连蛋白1、前脑啡肽、 整联蛋白β -样1 (含EGF-样重复结构域)、智人mRNA全长插入片段cDNA克隆EUR0IMAGE 1968422、EphA3、KIAA0367蛋白、钠尿肽受体C/鸟苷酸环化酶C (房钠尿肽受体C)、假设的 蛋白 FLJ14054、智人 mRNA、cDNA DKFZp564B222 (来自克隆 DKFZp564B222)、BCL2/ 腺病毒 ElB19kDa干扰蛋白3-样、AE结合蛋白1和细胞色素c氧化酶亚基VIIa多肽1 (肌肉)。
在一些实施方式中，所述细胞的特征为MCP-I、IL-6、IL-8、GCP-2、HGF、KGF、FGF, HB-EGF、BDNF、TPO、MIPla、RANTES和TIMPl中至少一种的分泌。在一些实施方式中，所述细 胞的特征为缺乏TGF-β 2、ANG2、PDGFbb、MIPlb、I309、MDC和VEGF中至少一种的分泌，如通 过ELISA检测的。
在优选的实施方式中，所述细胞包括上面所列生长、蛋白质/表面标记物的产生、 基因表达或物质分泌特征中的两种或更多。更优选的是包括三、四或五或更多种所述特征 的那些细胞。甚至更优选的是包括六、七或八种所述特征的那些细胞。甚至更优选的是包 括所有上述特征的那些细胞。
在优选用于本发明多个方面的细胞中，是具有上述特征的细胞，更特别的是那些 其中所述细胞具有正常核型并随着传代保持正常核型的细胞，并且此外，其中所述细胞表 达标记物⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr- α和HLA-A、B、C中的每一种，其中所述细胞 产生免疫可检测的蛋白，所述蛋白相应于所列的标记物。还更优选的是除前述外不产生相 应于标记物⑶31、⑶；34、⑶45、⑶117、⑶141或HLA-DR、DP、DQ中任一种的蛋白质的那些细 胞，如通过本领域任何适宜的方式诸如流式细胞术检测的。高度优选的是不表达CD117或HLA-DR的细胞。
在高度优选的方面，所述方法包括为需要治疗至少一个患病的或受损伤的肾脏的 受试者给药从人脐带组织获得或分离的细胞，其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩 增，需要L-缬氨酸用于生长，可在至少约5%氧气中生长，不产生⑶117或HLA-DR，表达α 平滑肌肌动蛋白，并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧 化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。可在给药之前，将从人脐带组织分离出的 细胞在培养中进行扩增。在一些实施方式中，从人脐带组织获得的所述细胞具有分化为至 少一个肾脏表型的细胞的潜能。可使用Pax-2的表达，由肾上皮祖细胞表达的转录因子，鉴 别脐带组织来源的细胞向肾脏表型或肾细胞谱系的分化。同样可通过三维胶原凝胶中的血 管生成和分支形态发生来证实脐带组织来源的细胞的肾细胞分化。
某些细胞具有沿着导致多种表型的细胞系分化的潜能，它们是不稳定的，因此它 们可自发地分化。目前优选用于本发明的是不自发分化的细胞，例如沿着肾脏细胞系。优 选的细胞，当在生长培养基中生长时，就在它们表面产生的细胞标记物和多种基因的表达 模式而言，是基本稳定的，例如使用基因表达谱测定的，例如，通过使用核酸或多肽阵列。所 述细胞基本保持恒定，例如传代期间、经过倍式群体倍增过程中它们的表面标记物物特征。
在本发明方法中，所述脐带组织来源的细胞可与其他治疗细胞和/或生物活性剂 诸如抗血栓形成剂、抗细胞凋亡剂、抗炎剂、免疫抑制剂(例如，环孢菌素、雷帕霉素)、抗氧 化剂或本领域常用于治疗肾脏损伤或疾病的其他药物诸如伊罗地塞(eprodisate)和雷公 藤内酯联合给药。脐带组织来源的细胞可与HMG-CoA还原酶抑制剂联合给药，所述HMG-CoA 还原酶抑制剂包括但不限于辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀和阿托 伐他汀。所述脐带组织来源的细胞可与其他细胞或药物顺序给药或同时给药。适当时也可 为患者给药裂解物、可溶性细胞碎片、膜浓缩的细胞碎片、细胞培养基(例如，条件培养基) 或来源于脐带组织来源的细胞的细胞外基质，包括与脐带组织来源的细胞本身和另外的细 胞或药物同时给药。所选择的特定药物可由直接治疗患者的医学技术人员决定，并可根据 特定需要或患者的状况而发生变化。所选择的药物可被用于多种目的诸如，但不限于，促进 所述细胞的给药，改善肾脏的修复和/或再生，改善患者的整体健康，减轻疼痛，减轻或防 止所移植的细胞的排斥等。
肾脏组织修复和再生的易化可经由脐带组织来源的细胞分泌的营养因子。例如， 保护肾脏的效能可参照经由脐带组织来源的细胞旁分泌或营养因子介导的机理。所述因子 包括，例如，肝细胞生长因子(HGF)、骨变形蛋白-7(BMP-7)、转化生长因子β (TGF-β)、基 质金属蛋白酶2(ΜΜΡ1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。脐带组织来源的细胞给药可 提供一种或更多保护肾脏的因子的持续释放。由脐带组织来源的细胞提供的保护肾脏的因 子的营养支持或释放可被用于代替一种或更多保护肾脏的因子的给药，或在一种或多种保 护肾脏的因子给药之外使用。
所述方法具有治疗肾脏损伤的实用性。所述方法具有治疗肾脏损伤包括急性肾功 能衰竭或损害或导致病态或缩短预期寿命的慢性肾脏疾病。可通过本发明修复并逆转的损 伤的一些非限制性实例包括手术除去肾脏的任何部分(或所有部分)、药物诱导的损伤、毒 素诱导的损伤、辐射诱导的损伤、环境暴露诱导的损伤、声波损伤、热损伤、缺氧性损伤、氧 化损伤、病毒损伤、年龄或老化相关的损伤、炎症诱导的损伤、免疫细胞诱导的损伤，例如，移植排斥、免疫复合物诱导的损伤等。与肾脏病理学相关的五种主要药物类别是靶向血液 动力学、代谢、纤维变性、炎症或免疫调节过程的药物。脐带组织来源的细胞可通过作用于 一种或更多的这些生理过程而发挥它们的作用。
所述细胞可以药物/治疗细胞组合物的形式给药，其包括药学上可接受的载体和 在此所述和例证说明的脐带组织来源的细胞。治疗细胞组合物可包括被诱导沿着肾脏细胞 途径或谱系分化的脐带组织来源的细胞。所述治疗细胞组合物可包括刺激患者肾脏中的细 胞分裂、分化的细胞或细胞产物，或同时包括这样的细胞或细胞产物。优选给药时诱导、促 进或支持患者的肾脏修复和/或再生的治疗细胞组合物。
所述细胞可通过注射为患者给药。例如，所述细胞可被直接注射患者的一个或两 个肾脏，或可在肾脏的表面注射进入邻近区域或甚至随后迁移至患者肾脏的更远区域。在 一些优选的方面，所述细胞可回归至患病的或受损伤的区域。特别优选的是可静脉注射并 适当地定位于预期的作用位点的细胞，例如肾脏细胞或它们的前体优选能够定位并回归至 肾脏或其结构或亚结构。
所述细胞也可以装置诸如基质-细胞复合物的形式给药。装置材料包括但不限于 生物吸收性材料诸如胶原、35/65聚(ε -己内酯)(PCL)/聚(乙醇酸)(PGA)、PanaCryl 生 物吸收性构成物、Vicryl 羟基乳酸聚合物910和自组装肽以及非吸收性材料诸如氟聚合 物(例如，Teflon 氟聚合物)、塑胶和金属。基质包括生物相容性支架、格子、自组装结构 等，不论生物吸收性或非生物吸收性的液体、凝胶或固体。所述基质在治疗学细胞治疗、手 术修复、组织工程和伤口愈合领域是已知的。优选地，所述基质是采用所述治疗学细胞预处 理的。更优选地，所述基质是和与基质或其空间密切相关的细胞一起居住的。所述细胞可附 着于所述基质或可被俘获或包含于所述基质空间之内。最优选的是基质-细胞复合物，在 其中所述细胞的生长与所述基质密切相关，并且当用于治疗时，患者自己的肾脏细胞的生 长、修复和/或再生被刺激和支持，适当的血管发生被相似地刺激或支持。所述基质-细胞 组合物可以本领域已知的任何方式被引入患者体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、 与其他组织一起移植等。在一些实施方式中，根据本发明可使用体内的基质形式、或甚至更 优选原位，例如原位可聚合的凝胶。所述凝胶的实例是本领域已知的。
可将本发明的所述细胞接种于这样的三维基质中，诸如支架和被植入体内的，其 中所接种的细胞可在框架上或框架中增殖，或有助于建立体内置换组织，与其他细胞协同 或不与其他细胞协同。脐带组织来源的细胞在三维框架上的生长导致三维组织的形成或建 立，这可被体内利用，例如用于修复和/或再生受损伤的或患病的组织。例如，可使用三维 支架以形成管状结构，例如用于肾脏血管的修复，或肾脏系统或肾脏结构的多种其他方面。
可将所述细胞接种于三维框架或基质上，诸如支架、泡沫状物或水凝胶，并相应地 给药。可将所述框架塑造成多种形状，诸如大体上扁平的、大体上圆柱状的或管状的形状， 或可为完全自由的形式，因为可要求或期望所述框架用于在考虑中的矫正结构。可将两个 或更多大体上扁平的框架放置于另一个的顶上并一起固定以产生多层框架。
在一些方面，所述细胞生长于所述三维结构上，在一些方面，所述细胞只能存活或 甚至死亡，尽管如此它们仍可刺激或促进肾脏组织的修复和再生，例如，优选地促进或支持 血管形成。
在这样的三维框架上，所述细胞可与其他肾脏细胞类型或其他软组织类型前体包药。当在这样的三维系统中生长时，增殖的细胞成熟并适当地分离以形成 类似于体内天然形成的成熟组织的组分。
可将在此所描述和例证说明的基质如此设计，所述基质结构支持脐带组织来源的 细胞，而没有随后的降解，从接种的时间直至组织移植物被宿主组织改型均支持所述细胞， 或允许所接种的细胞附着、增殖并发展成组织结构，所述组织结构具有足够的机械完整性 以在体外支持其自身，在该时间点，所述基质退化。
在此考虑使用的基质、支架、泡沫状物和自组装系统可与任何一种或多种细胞、生 长因子、药物或其他组分组合植入，所述其他组分诸如促进愈合、再生、修复、或组织的向内 生长、或刺激血管形成或其神经支配或在其他方面增强或改善本发明的治疗结果或实践， 除本发明的细胞外。在一个优选的方面，将包括一种或更多HMG CoA还原酶抑制剂的装置 与脐带组织来源的细胞一起接种。可将所述HMG CoA还原酶抑制剂泵入到所述装置中。可 将一种或更多HMG CoA还原酶抑制剂并入到所述装置中。
在一些实施方式中，将与本发明细胞一起被接种的装置用一种或更多HMG CoA还 原酶抑制剂处理。可将所述装置进行体内植入。
所述细胞可在培养中自由地生长、从培养中除去并被接种于三维框架中。含一定 浓度细胞的三维框架的接种，例如，大约IO6至5X IO7细胞每毫升，优选地导致所述三维支 持物在相对较短的时间周期内建立。此外，在一些应用中，可优选使用更大或较小数目的细 胞，取决于期望的结果。
在一些方面，在培养中重新形成在体内发现的细胞微环境是有用的，如此以来，所 述细胞在植入体内之前生长或用于体外的程度可发生变化。可在细胞形成期望用于植入的 形状(例如，绳、导管、细丝等)之前或之后，将所述细胞接种于所述框架中。在将所述细胞 接种于所述框架之后，优选将所述框架在适宜的生长培养基中孵育。在孵育期，所接种的细 胞将生长并包封所述框架，并可例如架桥或在其中的任何细胞间隙部分架桥。优选但不是 要求的，使细胞生长至反映正在被修复或再生的肾脏组织体内细胞密度的适宜程度。在其 他实施方式中，所述细胞的存在，即使在框架中以较低的数目存在，助长内源健康细胞的向 内生长以促进例如受损伤或受损害的组织的愈合。
基质的实例，例如可被用于本发明方面的支架，包括垫子(编织的、针织的，更优 选非编织的)多孔或半多孔泡沫状物、自组装肽等。非编织的垫子，例如，可使用包括天然 或合成聚合物的纤维来形成。在一个优选的实施方式中，使用了乙醇酸和乳酸(PGA/PLA) 的可吸收共聚物(以商品名VICRYL (Ethicon，Inc.，Somerville, NJ)出售)以形成 垫子。如美国专利号6355699中所讨论的，通过诸如冷冻-干燥或冻干工艺形成的泡沫状 物，包括例如聚(ε -己内酯)(PCL)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物，也可用作支架。凝胶 也可形成适宜的基质，如在此所用的。实例包括原位可聚合的凝胶和水凝胶，例如包括自组 装肽。这些材料经常被用作组织生长的支持物。原位形成的可降解网状物也适用于本发明 (参见，例如，Anseth, K. S. et al，2002，J. Controlled Release 78 :199-209 ；Wang，D.等 人 2003, Biomaterials 24 :3969-3980 ；美国专利出版物 2002/0022676to He 等人)。将这 些材料制成适宜用于注射的液体，然后可通过多种方法(例如，温度、PH的变化，暴露于光) 诱导在原位或体内形成可降解的水凝胶网络状物。
所述框架可为毡垫圈，它可包括由生物吸收性材料制成的复丝(multifilament14yarn)，例如，PGA、PLA、PCL共聚物或掺和物，或透明质酸。使用标准的纺织工艺技术将所述 丝制成毡垫圈，所述技术由卷曲、切割、梳理和针刺。可将本发明细胞接种于泡沫状支架上， 所述支架可为复合材料结构。此外，可将所述三维框架塑造成有用的形状，诸如在待修复、 替换或增强的肾脏内或周围的特殊结构。
在接种本发明的细胞之前，可将所述框架进行处理以增强细胞附着。例如，在接种 本发明的细胞之间，可将尼龙基质用0. 1摩尔的醋酸处理并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中 孵育以覆盖尼龙。可使用硫酸对聚苯乙烯进行相似地处理。
此外，可对所述三维框架的外表面进行改良以改善细胞的附着或生长以及组织 的分化，诸如通过血浆覆盖框架或添加一种或更多蛋白质(例如，胶原、弹性纤维、网状纤 维)、糖蛋白、葡糖氨基聚糖(例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸 皮肤素、硫酸角质素)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂 糖和植物胶，在其他材料之中。
所述支架可包括赋予其非血栓形成性的材料或采用这样的材料对其进行处理。这 些处理和材料也可促进并支持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例 包括但不限于天然材料诸如基膜蛋白诸如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料诸如ePTFE， 以及分节的聚氨酯脲硅酮，诸如PURSPAN (聚合物技术集团，Inc. ,Berkeley,CA) 0可 将这些材料进行进一步处理以赋予所述支架非血栓形成性。这样的处理包括抗血栓药诸如 肝素，以及改变所述材料表面电荷的处理诸如血浆覆盖。
多种类型胶原的不同比例，例如，沉积于框架中的、可能影响组织特异的或其他细 胞的生长，以后可将这些细胞接种于框架中或可能在体内结构中生长。备选地，可采用细胞 的混合物对框架进行接种，所述混合物合成期望的适当的胶原类型。取决于待培养的组织， 可选择待接种于框架中的适当的胶原类型或由接种于其中的细胞产生的适当的胶原类型。 例如，框架中存在的胶原纤维和弹性纤维的相对量可通过控制最初接种物中产生胶原的细 胞与产生弹性蛋白的细胞的比率来调制。例如，由于动脉的内壁富含弹性蛋白，因此动脉支 架应包含分泌弹性蛋白的平滑肌细胞的共培养。
接种过或接种过的本发明三维框架可用于从基质获得的培养细胞或体内培养的 基质本身的移植或植入。根据本发明，所述三维支架可用于替换或增大现存的组织、引入新 的或改变了的组织、修正人工假体或链接生物组织或结构。例如，但不是限制性的，所述三 维框架可用于在体外构造单层和多层管状组织，所述管状组织可在体内用作受损伤的或患 病的管状组织的替代物。
支架可被切割成长条(例如，矩形形状)，所述长条的宽度大约等于管状器官的内 部周长，所述管状器官例如肾盏或输尿管，所述长条最终将被插入到所述管状器官中。可将 所述细胞接种于所述支架上并通过漂浮或混悬于液体培养基中进行孵育。在融合的适当阶 段，可通过将长边连接起来而将所述支架卷入小管中。通过使用适宜材料、适当直径的纤维 将两边缝合而闭合接口处。
根据本发明，可将支架形成小管，与脐带组织来源的细胞一起接种，并混悬于位于 孵育箱中的培养基中。为了防止细胞从管腔流出，可将管状框架的一个开放端附着于喷 嘴。可将液体培养基通过该喷嘴从连接于孵育箱的源箱中压入以创造穿过所述管状框架 内部的液体流。可将另一开放端附着于一个导入收集箱的流出孔，在该收集箱中所述培养基可被再循环穿过所述源箱。当孵育完成时，所述小管可与喷嘴和流出孔分离。该方法在 Ballermann,B. J.等人的国际申请号WO 94/25584和美国申请系列号08/430768中进行了 描述，在此通过引用并入二者整体作为参考。
一般而言，根据本发明使用任何下述方法，可将两个三维框架组合成小管。可将两 个或更多扁平的框架放置在另一个顶上并缝合起来。然后可将该两层薄片卷起来并如上所 述连接起来并固定。
可将用作内层的一个管状支架与脐带组织来源的细胞一起接种并孵育。第二支架 可作为扁平长条生长，其宽度稍微大于所述管状框架的外部周长。在达到适当的生长后，可 将扁平框架环绕在所述管状支架的外面，随后通过闭合所述扁平框架两边的接口处，优选 地，将扁平框架固定于内部的小管。
直径稍微不同的两个或更多管状网孔可分别生长。可将具有较小直径的框架插入 到具有较大直径的框架内并固定。
对于这些方法中的每一种而言，可通过将该方法再应用于双层小管而添加更多的 层。可将所述支架在脐带组织来源的细胞生长的任何阶段进行组合，在需要时可将组合的 支架继续孵育。
管状构造的内腔方面可包括赋予所述管状支架的内腔表面非血栓形成性的材 料，或用这些材料处理所述管状构造的内腔方面。这些处理和材料也可促进并支持内皮 生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料诸如基膜 蛋白诸如层粘连蛋白和IV型胶原、合成材料诸如ePTFE，以及分节的聚氨酯脲硅酮，诸如 PURSPAN (聚合物技术集团，Inc.，Berkeley, CA)。可将这些材料进行进一步处理以 赋予所述管状支架非血栓形成性。这样的处理包括抗血栓药诸如肝素，以及改变所述材料 表面电荷的处理诸如血浆覆盖。
在一些目前优选的实施方式中，所述方法包括诱导治疗学的产后来源的细胞沿着 肾脏细胞途径分化，朝着肾脏细胞表型或前体或前述更原始的相关物(relatives)分化。 所述治疗学细胞组合物可并入患者的肾脏，或备选地，可为天然存在的肾脏干细胞提供支 持用于生长或刺激以进行分化。治疗学细胞可与细胞裂解物，或与其他同种异体的、同基因 的或自体的细胞一起给药。以给药治疗学细胞组合物方式递送的细胞的存活不是成功或它 们的用途结果的决定性因素，倒不如肾脏健康的改善或整体的患者健康是结果决定性的。 因此，所述细胞不需要与患者的肾脏结合，或甚至并入血管，但治疗前和治疗后患者肾脏健 康的改善标记包括肾脏健康的至少一种客观测量，所述客观测量诸如但不限于，血清或关 于肌酸酐、尿素、蛋白、血尿素氮(BUN)的尿分析，渗透性化验以及患者情况的主观评价(包 括自评价)方面的改善。
因此成功的治疗可包括采用包含脐带组织来源的细胞的治疗学细胞组合物对具 有肾脏疾病、病状或创伤的患者进行治疗，在另一种细胞类型的存在下或不存在另一种细 胞类型。例如，但不是限制性的，所述细胞优选至少部分并入患者、在患者中繁殖或存活。在 其他优选的实施方式中，患者经历来自治疗的益处，例如来自所述细胞支持其他细胞生长 的能力，包括肾脏中存在的干细胞或前体细胞，来自组织向内生长或组织的血管形成，以及 来自有益细胞的因子、炎症趋化因子、细胞因子等的存在，但所述细胞不并入患者或在患者 中繁殖。在一些方面，患者受益于采用所述细胞进行的治疗学治疗，但所述细胞不在患者中长时间存活。例如，在一个实施方式中，所述细胞在数量、生存力或生化活性方面逐渐衰退。 在其他实施方式中，细胞的所述衰退可被活性周期领先，例如生长、分裂或生活活性。在其 他实施方式中，衰老的、不能生存的或甚至死亡的细胞能够具有有益的治疗学作用。
给药优选在体内通过移植、植入、注射、输注、经由导管递送、或作为基质-细胞复 合物提供、或本领域已知的任何其他方式提供细胞治疗。
在一些方面，本发明方法可进一步包括评价患者的肾脏结构和/或功能的改善， 或整体健康的改善。所述评价可根据适用于本领域的任何方式进行，包括在此描述并例证 说明的那些方式。
根据本发明同样描述了用于实践本发明方法的试剂盒的特征。在一个方面，提供 了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒。所述试剂盒包括药学上可接受的 载体、治疗所述疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，诸如在此描述并例证说明 的那些细胞，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使用所述试剂盒的指 导。所述试剂盒可进一步包括至少一种试剂和用于培养所述细胞的指导。所述试剂盒可进 一步包括至少一种其他细胞类型的群，和/或至少一种药物。
在一些方面，所述试剂盒包括药学上可接受的载体、裂解物、细胞外基质或由从人 脐带组织获得的细胞制备的条件培养基，其中细胞具有在此描述并例证说明的特征。所述 试剂盒具有促进受损伤的或患病的肾脏修复和/或再生的效用。
提供了下面的实施例以更详细地描述本发明。它们是说明性的，不限制本发明。
实施例1
脐带组织来源的细胞的分离
M ^^/Λ National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) 获得的。这些组织是在正常分娩之后获得的。细胞分离方案是在层流洁净工作台中在 无菌条件下进行的。为了除去血液和碎片，将脐带在磷酸盐缓冲盐水(PBS ;InVitr0gen， Carlsbad,CA)中在抗真菌药和抗生素(100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，0. 25 微克/毫升两性霉素B)存在下洗涤。然后将这些组织在150cm2组织培养皿中在50毫升培 养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖，Invitrogen)存在下进行机械离解，直至该组织被 绞碎成细浆。将该剁碎的组织转移至50毫升锥形管中(大约每管5克组织)。然后将该组 织在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基中消化，每一种培养基中均含有如上 所述的抗真菌药和抗生素。在一些实验中，使用了胶原酶和分散酶的酶混合物(“C D;” 胶原酶(Sigma，St Louis, MO)，500单位/毫升；以及分散酶(Invitrogen)，50单位/毫 升，于DMEM -低葡萄糖培养基中)。在其他实验中，使用了胶原酶、分散酶和透明质酸酶 (“C D H”)的混合物(胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；以及透明质 酸酶(Sigma)，5单位/毫升，于DMEM:-低葡萄糖中)。将含有组织、培养基和消化酶的锥 形管在37°C在定轨振荡器(Environ，Brooklyn, NY)上225rpm下孵育2小时。
消化后，将该组织在150X g下离心5分钟，吸出上清液。将沉淀再次混悬于20毫 升生长培养基(DMEM:低葡萄糖anVitr0gen)，15% (ν/ν)胎牛血清(FBS，定义为牛血清， Lot#AND18475, Hyclone, Logan, UT) ,0. 001% (ν/ν) 2-巯基乙醇(Sigma)、lml/100ml 的如 上所述的抗生素/抗真菌药中。将该细胞混悬物过滤通过70-微米尼龙细胞过滤网(BD Biosciences)。使包含生长培养基的另外5毫升漂洗液通过该过滤网。然后将该细胞混悬物通过40-微米尼龙细胞过滤网(BD Biosciences)，并追加另外5毫升的生长培养基。
将该滤液再次混悬于生长培养基(总体积50毫升)中并在150Xg下离心5分钟。 吸出上清液并将细胞再次混悬于50毫升的新鲜生长培养基中。将该过程再重复两次。
在最后离心时，吸出上清液并将细胞沉淀再次混悬于5毫升新鲜生长培养基中。 使用锥虫蓝染色测定存活细胞的数目。然后将细胞在标准条件下培养。
将从脐带分离出的细胞以5000细胞/cm2的密度在明胶-覆盖的T-75cm2培养瓶 (Corning Inc. ,Corning,NY)中接种于含如上所述的抗生素/抗真菌药的生长培养基中。2 天(在不同实验中，将细胞孵育2-4天)后，从培养瓶中吸出用过的培养基。将细胞用PBS 洗涤三次以除去碎片和血液来源的细胞。然后将细胞再次充满生长培养基并使其生长至融 合(从0代起约10天)至1代。在随后的传代(从1代至2代等)中，细胞在4-5天内达 到亚融合(75-85%融合)。对这些随后的传代而言，将细胞以5000细胞/cm2的密度接种。 使细胞在含5%二氧化碳和大气氧的增湿培养箱中在37°C生长。
实施例2
通过流式细胞术讲行的人产后来源的细胞表面标记物的评价
使用流式细胞术鉴定脐带组织以提供用于从中获得的细胞鉴别的图谱。
将细胞在含青霉素/链霉素的生长培养基(Gibco Carlsbad, CA)中培养。将细胞 培养在血浆处理过的T75、T150和T225组织培养瓶(CorningCorning，NY)中直至融合。通 过将2% (w/v)明胶(Sigma，St. Louis, MO)在室温孵育20分钟而将培养瓶的生长表面覆 盖上明胶。
将培养瓶中的贴壁细胞在PBS中洗涤并用胰蛋白酶/EDTA分离。收集细胞、离心 并以IXlO7每毫升的细胞浓度再次混悬于于PBS中3% (ν/ν)的FBS中。根据生产商的 说明书，将目标细胞表面标记物的抗体(参见下面)加入到一百微升细胞混悬液中，并将该 混合物在暗处、在4°C孵育30分钟。孵育后，将细胞用PBS洗涤并离心以除去未结合的抗 体。将细胞再次混悬于500微升PBS中并通过流式细胞术分析。流式细胞术分析是采用 FACScalibur 仪器(Becton Dickinson, San Jose, CA)进行的。0116]使用了细胞表面标记物的下列抗体。0117]抗体生产商目录号0118]CDlOBDPharmingen(San Diego, CA)5553750119]CD13BDPharmingen5553940120]CD31BDPharmingen5554460121]CD34BDPharmingen5558210122]CD44BDPharmingen5554780123]CD45RABDPharmingen5554890124]CD73BDPharmingen5502570125]CD90BDPharmingen5555960126]CD117BDPharmingen3405290127]CD141BDPharmingen5597810128]PDGFr- αBDPharmingen5560020129]HLA-A，B, CBD Pharmingen55555318
HLA-DR, DP, DQ BD Pharmingen555558
IgG-FITCSigma(St. Louis, MO)F-6522
IgG-PESigmaP-4685
将细胞在8、15和20代时进行分析，并将来自不同供体的脐带组织来源的细胞进 行相互比较。此外，将在明胶覆盖的培养瓶中培养的细胞和在不覆盖的培养瓶中培养的细 胞进行比较。
脐带组织来源的细胞显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr_a 和 HLA_A、B、C 的阳性表达，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值表征的。这些细胞对⑶31、⑶34、⑶45、 ⑶117、⑶141和HLA-DR、DP、DQ的可检测表达而言是阴性的，这是由与IgG对照可比的荧光 数值表征的。对阳性曲线荧光数值的变异进行了说明。阳性曲线的平均值(即，CD13)和 范围(即，CD90)显示一些变异，但这些曲线看起来是正常的，证实了同源细胞群。两条曲 线均各自地显示大于IgG对照的数值。
8、15 和 20 代的细胞均表达 CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90,PDGFr-α 和 HLA_A、B、 C，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值表征的。这些细胞对⑶31、⑶34、⑶45、⑶117、 ⑶141和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，这是由与IgG对照一致的荧光数值表征的。
来自单独供体的分离物均显示CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α 和 HLA-A、 B、C的阳性表达，这是由相对于IgG对照增加的荧光数值反映的。这些细胞对⑶31、⑶34、 ⑶45、⑶117、⑶141和HLA-DR、DP、DQ的表达而言是阴性的，它们具有与IgG对照一致的荧 光数值。
在明胶覆盖的和不覆盖明胶的培养瓶中扩增的细胞对⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶ 90、PDGFr- α和HLA-A、B、C的表达而言均是阳性的，它们具有相对于IgG对照增加的荧光 数值。这些细胞对CD31、CDiM、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ而言是阴性的，它们具有与IgG对照一致的荧光数值。
因此，脐带组织来源的细胞对⑶10、⑶13、⑶44、⑶73、⑶90、PDGFr-α和HLA-A、 B、C而言是阳性的，对⑶31、⑶34、⑶45、⑶117、⑶141和HLA-DR, DP、DQ而言是阴性的。该 鉴别变量的变异之间是一致的，所述变量包括供体、传代和培养容器表面覆盖层。在个体荧 光数值直方图中观察到了平均值和范围的一些变异，但在所有所测试条件下的所有阳性曲 线是正常的并表达大于IgG对照的荧光数值，从而证实了所述细胞包括具有所述标记物阳 性表达的同源细胞群。
实施例3
细胞表现型的免疫组织化学鉴定
将人脐带组织收集并浸没固定于4% (w/v)低聚甲醛中在4°C过夜。使用直接对 抗下列表位的抗体进行免疫组织化学波形蛋白(1 500 ;Sigma，St.Louis，M0)、结蛋白 (1 150，对抗家兔增高的；Sigma ；或1 300，对抗小鼠增高的；Chemicon，Temecula，CA)、 α-平滑肌肌动蛋白(SMA;1 400 ;Sigma)、细胞角蛋白 18(CK18 ;1 400 ； Sigma)、von Willebrand 因子(vWF ;1 200 ;Sigma)和 CD34 (人 CD34III 类，1 100, DAKOCytomation, Carpinteria,CA)。此外，测试了下列标记物抗人61 0 0^^ (1 100 ；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、抗人 GCP-2 (1 100 ；Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)、抗人 氧化的 LDL 受体 l(ox-LDL Rl ； 1 100 ；Santa Cruz Biotech)和抗人 N0G0-A (1 100 ；19Santa Cruz Biotech)。将固定的样本用解剖刀修剪并将其放置于含乙醇的干冰浴上的OCT 埋封胶(Tissue-Tek OCT ；Sakura, Torrance, CA)内。然后使用标准低温恒温器(Leica Microsystems)将冰冻块切开(10 μ m厚)并装在载玻片上用于染色。
类似于之前的研究(Messina等人Q003) Exper. Neurol. 184 :816-29)进行免疫组 织化学。简单而言，将组织切片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并将其暴露于含PBS、4% (ν/ ν)山羊血清(Chemicon，iTemecula, CA)和 0· 3% (v/v) Triton (Triton X-100 ；Sigma)的蛋 白质阻断溶液中1小时以接近细胞内抗原。在目标表位将被定为于细胞表面(CD34、ox-LDL Rl)的情况中，在操作的所有步骤中省略Triton以防止表位损失。此外，在第一抗体对抗 山羊增高的(GCP-2，ox-LDL RLN0G0-A)的情况中，在整个操作过程中使用3% (ν/ν)驴血 清代替山羊血清。将第一抗体在阻断溶液中稀释，然后将其加载到切片，在室温保持4小 时。除去第一抗体溶液，并在加载含有连同山羊抗-小鼠IgG-Texas Red(l 250，分子探 针，Eugene，0R)和/或山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(1 250，分子探针)或驴抗-山羊 IgG-FITCd 150 ；SantaCruz Biotech) —起的阻断的第二抗体溶液(在室温1小时)之 前，将培养物用PBS洗涤。洗涤培养物，并加载10微摩尔DAPI (分子探针)持续10分钟以 使细胞核可见。
使用适当的荧光滤镜在Olympus倒置表面荧光显微镜(Olympus，Melville, NY) 下使荧光可见。阳性染色是由高于对照染色的荧光信号代表的。使用数字彩色摄像机和 ImagePro软件(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)获取代表性图像。对三重染色的样品 而言，一次只使用一个发射滤镜采集每一份图像。
一组存在于脐带中的细胞表达波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vffF和⑶34标记物。 特别地，vWF和⑶34表达局限于包含于脐带内的血管。⑶34+细胞位于最内层(内腔侧)。 在基质和脐带的血管中均发现了波形蛋白表达。SMA限于基质和动脉&静脉的外壁，但不包 含于血管本身。只在血管内观察到了 CK18和结蛋白，结蛋白局限于中间层和外层。在脐带 组织内未观察到GRO α、GCP-2、ox-LDL Rl和N0G0-A的表达。
实施例4
寡核苷酸阵列分析
使用了 Affymetrix GeneChip 阵列以比较脐带组织来源的细胞和成纤维细胞、 人间质肝细胞以及人骨髓来源的另一细胞系的基因表达谱。该分析提供了产后来源的细胞 的鉴定，并鉴别了这些细胞的独特分子标记物。
ΛΜτ ^/Λ National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) 获得的，来自患者知情同意的正常足月分娩。接收了这些组织，并如上所述分离了细胞。将 细胞培养于生长培养基(使用DMEM-LG)中，在明胶覆盖的组织培养塑胶培养瓶中。将该培 养物在37°C、在5% CO2下孵育。
人真皮成纤维细胞购买自Cambrex Incorporated (ffalkersvi 1 Ie, MD,批号 9F0844)和ATCC CRL-1501 (CCD39SK)。将两个细胞系均培养于含10 % (ν/ν)胎牛血清 (Hyclone)和青霉素 / 链霉素(Invitrogen)的 DMEM/F12 培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。使这些细胞生长于标准组织处理过的塑胶上。
人间质干细胞(hMSC)购买自Cambrex Incorporated (ffalkersvi 1 Ie, MD，批号 2F1655、2F1656和2F1657)，并根据生产商的说明书将其培养于MSCGM培养基(Cambrex)中。使这些细胞在37°C、在5% CO2下生长于标准组织培养过的塑胶中。
人髂嵴骨髓来自NDRI，具有患者的知情同意。将骨髓根据Ho等人(W003/025149) 提出的方法进行处理。将骨髓与溶菌缓冲液(155mM NH4CiaOmM KHCO3和0. ImM EDTA, pH 7.2)以1份骨髓对20份溶菌缓冲液的比率混合。将该细胞混悬液进行涡旋，在室温孵育2 分钟，并在500Xg下离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀再次混悬于补充有10% (ν/ ν)胎牛血清和4mM谷氨酰胺的最低必需培养基-α (Invitrogen)中。将该细胞再次离心， 并将细胞沉淀再次混悬于新鲜培养基中。使用锥虫蓝拒染法(Sigma，St. Louis,M0)对存活 的单核细胞进行计数。将该单核细胞以5X IO4细胞/cm2的密度接种于组织培养过的塑胶 培养瓶中。将该细胞在37°C、在5% CO2下、在标准大气O2或5% O2下孵育。将细胞培养5 天，而不更换培养基。在5天的培养之后除去培养基和非贴壁细胞。将贴壁细胞保持在培 养中。
使用于冷PBS中的细胞刮棒将细胞的活性生长培养物从培养瓶中除去。将该细胞 在300Xg下离心5分钟。除去上清液，并将该细胞再次混悬于新鲜PBS中并再次离心。除 去上清液，并将细胞沉淀立即冷冻并保存在-80°C下。提取细胞mRNA并将其转录为生物素 标记的cDNA，然后将该cDNA转录为cRNA。将该生物素标记的cRNA与HG-U133A基因芯片 寡核苷酸阵列(Affymetrix，Santa Clara CA)杂交。该杂交和数据采集是根据生产商的说 明书进行的。分析是使用“微阵列的显著性分析”(SAM)版本1. 21计算机软件(斯坦福大 学，Tusher 等人 Q001)Proc. Natl. Acad. Sci. USA98 :5116-21)进行的。
分析了十四个不同的细胞群。在表1中列出了这些细胞和传代信息、培养底物和 培养基。
表1
通过微阵列研究分析的细胞。通过识别码列出了细胞系、分析时的传代、细胞生长 底物和生长培养基。
权利要求
1.一种治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法，其包括为所述患者给药治疗疾 病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所 述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在 至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成 纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素 8或浆膜蛋白1。
2.根据权利要求1的方法，其中所述细胞表达氧化低密度脂蛋白受体1、浆膜蛋白、趋 化因子受体配体3和/或粒细胞趋化蛋白2。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细胞表达⑶10、⑶13、⑶44、⑶73和⑶90。
4.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是通过注射或输注给药的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是封装于可植入的装置中给药的。
6.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是通过植入包括所述细胞的基质给药的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是与至少一种其他细胞类型给药的。
8.根据权利要求7的方法，其中所述至少一种其他细胞类型是与从人脐带组织获得的 细胞同时、或其之前、或其之后给药的。
9.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是与至少一种药物给药的。
10.根据权利要求9的方法，其中所述至少一种药物是与从人脐带组织获得的细胞同 时、其之前、或其之后给药的。
11.根据权利要求1的方法，其中所述细胞对患者的肾脏发挥营养作用。
12.根据权利要求1的方法，其中所述对肾脏的损伤是由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴 露、放射暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起的。
13.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，其包括药学上可 接受的载体和治疗疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本 上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬 氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动 蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂 蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中所述对肾脏的损伤是由年龄、创伤、毒素暴 露、药物暴露、放射暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥引起的。
15.根据权利要求13的药物组合物，其进一步包括至少一种其他细胞类型。
16.根据权利要求13的药物组合物，其进一步包括至少一种药物。
17.根据权利要求13的药物组合物，其被制成用于注射或输注给药的剂型。
18.根据权利要求13的药物组合物，其中所述细胞封装于可植入装置中。
19.根据权利要求13的药物组合物，其中所述细胞被接种于基质中。
20.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的试剂盒，其包括药学上可接受 的载体、治疗疾病或损伤有效量的从人脐带组织获得的细胞，其中所述脐带组织基本上不 含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸 用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白； 并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1，以及在治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法中使 用所述试剂盒的指导。
21.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括用于培养细胞的至少一种试剂和指导。
22.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括至少一种其他细胞类型的群。
23.根据权利要求20的试剂盒，其进一步包括至少一种药物。
24.一种治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法，其包括为所述患者给药包括 可溶性细胞碎片、裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的细胞制备的条件培养基的 组合物，其中所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增， 并具有分化的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或 HLA-DR ；表达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表 达水平增加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
25.一种用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的药物组合物，其包括药学上可 接受的载体和裂解物、细胞外基质或由从人脐带组织获得的细胞制备的条件培养基，其中 所述脐带组织基本上不含血，且其中所述细胞能够在培养中自我更新和扩增，并具有分化 的潜能；需要L-缬氨酸用于生长；可在至少约5%氧气中生长；不产生⑶117或HLA-DR ；表 达α平滑肌肌动蛋白；并相对于人成纤维细胞、间质干细胞、或髂嵴骨髓细胞表达水平增 加的氧化低密度脂蛋白受体1、白介素8或浆膜蛋白1。
全文摘要
提供了用于治疗至少一个肾脏患病或受损伤的患者的方法。所述方法包括给药从人脐带组织获得的细胞，或给药包括所述细胞或从所述细胞制备的药物组合物。给药时，所述细胞促进或支持患者患病的或受损伤的肾脏组织的修复和再生。也提供了用于本发明方法的药物组合物，以及用于实践所述方法的试剂盒。
文档编号C12N5/073GK102036688SQ200880119184
公开日2011年4月27日 申请日期2008年10月3日 优先权日2007年10月5日
发明者A·戈谢夫卡, D·科尔特 申请人:伊西康公司