专利名称：检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测葡萄糖浓度的方法，特别是检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法。
背景技术：
通过测定不同发酵时间段b型流感嗜血杆菌发酵液中葡萄糖的含量变化情況，可以基本上表征出发酵过程中菌的生长情况，也可以对其发酵动力学及发酵过程中代谢产物的量有一定的表征，根据测定结果适时补充所需葡萄糖，可以促进更好的达到发酵目的。目前发酵液糖含量的測定主要有斐林法，3，5-ニ硝基水杨酸比色法(DNS法)、HPLC、葡萄糖试剂盒以及葡萄糖传感仪几种方式。其中斐林法对实验环境及实验者的滴定手法要求非常严格，因此测定结果重现性较差，不同实验者出现偏差较大；DNS法发酵液需经过处理，測定过程较为繁琐，測定时间较长；HPLC、葡萄糖试剂盒及葡萄糖传感仪成本较高。由于发酵液成分复杂，上述方法存在干扰现象，检测准确度不高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法，可直观、准确、迅速的检测发酵液中葡萄糖的含量，具有检测结果稳定、检测时间短，检测过程简捷、成本低的优点。本发明的目的通过以下技术方案来实现检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法，它包括以下步骤
A、以任ー时间段的Hib发酵液的样品作为供试品，取供试品2ml置于250ml锥形瓶中，加水25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；
B、加热回流使其在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，后立即加入25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液(I — 5) 25ml ；
C、待ニ氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近終点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失；
D、取水2ml做一空白试验；
E、发酵液零小时样品的測定，其包括以下步骤
1)、取2ml发酵液零小时样品，即加糖不加菌的样品，置于250ml锥形瓶中，加水25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；
2)、加热回流使其在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，立即加25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液(1 — 5) 25ml ；
3)、待ニ氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失；
F、以发酵液零小时样品消耗滴定液的体积为100%，其余样品消耗滴定液体积与发酵零小时样品消耗的滴定液体积进行比较，得到发酵液不同时段剩余葡萄糖含量占初始葡萄糖含量的百分比。本发明具有以下优点
本发明用检测还原糖的原 理，測定发酵液中不同发酵时间下的葡萄糖含量，可消除大部分干扰，准确度较高；采用了百分比的形式处理实验数据，更直观的表达了整个发酵过程菌的生长情况，解决了发酵过程中实时监控葡萄糖含量的问题，且检测结果稳定、检测时间短,检测过程简捷、成本低。本发明由于可直观、准确、迅速的检测发酵液中葡萄糖的含量水平，可作为判断菌体生长情况的重要依据，同时可及时监控菌体生长环境中碳源是否充足，为发酵过程的补料提供重要依据。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步的描述
实施例I :分别取发酵0小吋、I小吋、2小吋、3小吋、4小吋、5小吋、6小时的Hib发酵
液作为供试品，依次按下述方法进行葡萄糖含量检测。检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法包括以下步骤
A、以任ー时间段的Hib发酵液的样品作为供试品,取供试品2ml置于250ml锥形瓶中，加水25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；
B、加热回流使锥形瓶中溶液在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，后立即加入25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液(I — 5) 25ml ；
C、待ニ氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近終点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失；
D、取水2ml做一空白试验；
E、发酵液零小时样品的測定，其包括以下步骤
1)、取2ml发酵液零小时样品，即加糖不加菌的样品，置于250ml锥形瓶中，加水25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；
2)、加热回流使锥形瓶中溶液在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，立即加25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液(I — 5) 25ml ；
3)、待ニ氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失；
F、以发酵液零小时样品消耗滴定液的体积为100%，其余样品消耗滴定液体积与发酵零小时样品消耗的滴定液体积进行比较，得到发酵液不同时段剩余葡萄糖含量占初始葡萄糖含量的百分比。试验结果如下所示，以上几种供试品消耗的硫代硫酸钠体积(去空白后)分别为发酵I小时的Hib发酵液 3. 27 ml,
发酵2小时的Hib发酵液 3. 02 ml,
发酵3小时的Hib发酵液 2. 81 ml,
发酵4小时的Hib发酵液 2. 76 ml,
发酵5小时的Hib发酵液 2. 52 ml,
发酵6小时的Hib发酵液 2. 07 ml,
发酵液零小时样品3.44 ml通过上述试验结果可以得出发酵I小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时的Hib发酵液中剰余葡萄糖含量占初始葡萄糖含量的百分比分别为95. 06%,87. 79%，81. 69%，80. 23%, 73. 26%, 60. 17%。本发明采用了百分比的形式处理实验数据，測定发酵液中不同发酵时间下的葡萄糖含量，更直观的表达了整个发酵过程菌的生长情况，解决了发酵过程中实时监控葡萄糖含量的问题，且检测结果稳定、检测时间短，检测过程简捷、成本低，可作为判断菌体生长情况的重要依据，同时可及时监控菌体生长环境中碳源是否充足，为发酵过程的补料提供重要依据。
权利要求
1.检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法，其特征在于它包括以下步骤A、以任一时间段的Hib发酵液的样品作为供试品,取供试品2ml置于250ml锥形瓶中， 加水25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；B、加热回流使其在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，后立即加入25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液(I — 5) 25ml ；C、待二氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失；D、取2ml水做一空白试验；E、发酵液零小时样品葡萄糖含量测定；F、以发酵液零小时样品消耗滴定液的体积为100%，其余样品消耗滴定液体积与发酵零小时样品消耗的滴定液体积进行比较，得到发酵液不同时段剩余葡萄糖含量占初始葡萄糖含量的百分比； 其中，所述的发酵液零小时样品葡萄糖含量测定测定包括以下子步骤I)、取2ml发酵液零小时样品，即加糖不加菌的样品，置于250ml锥形瓶中，加水 25ml，精密加入碱性铜试液25ml ；2)、加热回流使其在3分钟内沸腾，并连续沸腾5分钟，迅速冷却至室温，期间保证瓶中氧化亚铜不与空气接触，立即加25%碘化钾溶液15ml，摇匀，随振摇随缓缓加入硫酸溶液 (1 — 5) 25ml ；3)、待二氧化碳停止放出后，立即用0.lmol/L的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴定至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失。
全文摘要
本发明公开了检测b型流感嗜血杆菌发酵液不同发酵时间剩余的葡萄糖浓度的方法，其主要是用硫代硫酸钠滴定液滴定任一时间段的Hib发酵液的样品，然后将该样品消耗的滴定液体积与发酵零小时样品消耗的滴定液体积进行比较，得到发酵液不同时段剩余葡萄糖含量占初始葡萄糖含量的百分比。本发明的有益效果是采用了百分比的形式处理实验数据测定发酵液中不同发酵时间下的葡萄糖含量，更直观的表达了发酵过程中菌的生长情况，检测结果稳定、检测时间短，检测过程简捷、成本低，可直观、准确、迅速的检测发酵液中葡萄糖的含量水平，可作为判断菌体生长情况的重要依据，同时可及时监控菌体生长环境中碳源是否充足，为发酵过程的补料提供重要依据。
文档编号G01N21/79GK102621140SQ201210036480
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者朱琳, 罗芹, 赵丹, 韩炼 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司