热带无爪螨重组变应原Blot5‑21、其制备方法及过敏小鼠模型的建立与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及热带无爪螨重组变应原blot5-21、其制备方法及过敏小鼠模型的建立。

背景技术：

尘螨是支气管哮喘发生的重要诱因之一，对尘螨敏感的人口比例高达10％，而在过敏性哮喘病人中，这个比例超过90％。尘螨中最主要的三种是粉尘螨(dermatophagoidesfarinae,derf)、屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus,derp)和热带无爪螨(blomiatropicalis,blot)。在热带和亚热带地区热带无爪螨是主要的螨种。

热带无爪螨，又称热带无爪螨，或热带螨，其分泌物、排泄物、虫卵等均能引起严重的过敏性哮喘、鼻炎等疾病。近年来，从热带无爪螨中至少分离出25种分子量大小在11～85kda的ige结合蛋白，已正式命名的有blot1、blot3、blot4、blot5、blot6、blot7、blot10、blot11、blot12、blot13、blot19和blot21等12种，其中分子量为11～14kda和16kda的成分是临床上重要的变应原。

研究表明，blot5和blot21是热带无爪螨的的主要变应原。blot5由热带无爪螨的肠上皮细胞分泌，主要存在于其肠壁和排泄物颗粒中。blot5是热带无爪螨的最重要的致敏成分，在对热带无爪螨敏感的人群调查中发现有40～60％的人的体内发现了blot5特异性的ige。blot21主要存在于b.t螨的肠的内容物中，blot21由129个氨基酸组成，与blot5有39％的序列一致性，其二级结构是α螺旋。大多数的过敏患者(>75％)能同时对blot5和blot21过敏，研究发现这两种抗原之间有中度的交叉反应性。

粗提螨浸液成分复杂，含有多种变应原和非变应原，处理不当可能含有内毒素，很难做到真正的标准化生产，同时其安全使用也受到了限制，而应用重组蛋白技术就可以解决这个问题。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：

热带无爪螨重组变应原blot5-21，该重组变应原通过下述方法制得：

(1)将热带无爪螨blot5基因序列和blot21基因序列融合在一起后进行密码子优化，然后进行全基因合成；

(2)将blot5-21基因序列连接至原核表达载体上，构建重组质粒；

(3)将重组质粒转入宿主细胞中，挑取单菌落至含有卡那霉素的lb培养基中，振摇8～24h，转接培养至od600nm＝0.5～0.7，然后加入iptg诱导，收集菌体，破碎菌体，取上清，进行重组蛋白的纯化，得到纯化后的rblot5-21蛋白。

优选的，所述步骤(2)中，所述的原核表达载体为pqe-80l，所述重组质粒为pqe80l-blot5-21。

优选的，所述步骤(3)为：将重组质粒pqe80l-blot5-21转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落至10ml～50ml含有卡那霉素的lb培养基中，振摇8～24h，转接培养至od600nm＝0.5～0.7，然后加入iptg，收集菌体，破碎菌体，取上清，进行重组蛋白的纯化，得到纯化后的rblot5-21蛋白。

优选的，所述步骤(3)中：iptg诱导的条件为：iptg浓度为0.1～1mmol/l、在37℃条件下进行诱导4～6h。

优选的，所述步骤(3)中的纯化过程为利用镍柱进行重组蛋白的纯化。

优选的，所述步骤(3)中，纯化方法为：先用10～15mmol/l咪唑缓冲液平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里；接着利用40～50mmol/l咪唑缓冲液漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；最后利用250～300mmol/l咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。

所述热带无爪螨重组变应原blot5-21在制备治疗热带无爪螨过敏性疾病的制剂中应用。

所述热带无爪螨重组变应原blot5-21可用于替代热带无爪螨的粗提总变应原混合物。

热带无爪螨过敏小鼠模型，通过下述方法建立：

将纯化的rblot5-21蛋白作为过敏抗原与氢氧化铝凝胶佐剂混合，小鼠腹腔注射rblot5-21/氢氧化铝的复合物，然后利用rblot5-21经过气管注入小鼠的肺组织，进行过敏模型的诱导。

优选的，所述的过敏小鼠模型，通过下述方法建立：

将1～10mgrblot5-21蛋白作为过敏抗原与50～500mg氢氧化铝凝胶佐剂混合，室温条件下震荡混合2～6小时，每只小鼠腹腔注射100～200μlrblot5-21/氢氧化铝的复合物，然后利用100～300μgrblot5-21经过气管注入小鼠的肺组织，进行过敏模型的诱导。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备纯化出具有天然免疫活性的重组热带无爪螨变应原blot5-21，该重组变应原有周期短、成本低等优点，以可溶蛋白形式表达，表达量高，且通过镍柱亲和层析就可以得到纯度较高的重组变应原blot5-21蛋白，实现热带无爪螨变应原的标准化，可作为对热带无爪螨过敏患者进行诊断和特异性免疫治疗的候选分子。

本发明利用纯化后的rblot5-21蛋白对balb/c小鼠进行过敏模型的诱导，建立小鼠过敏模型，为热带螨过敏的诊断与治疗打下基础，尤其为研究热带螨过敏的预防与治疗性疫苗或者药物提供了动物模型，同时，热带无爪螨与其他的尘螨之间存在一定的交叉反应性，因而本实验也为热带无爪螨与其他过敏原的交叉致敏反应的研究奠定了基础。

附图说明

图1：blot5基因和blot21基因融合重组质粒载体示意图。

图2：重组质粒非诱导菌体、诱导菌体表达产物的sds-page电泳图。

图中，泳道1为预染蛋白分子质量标准(fermentas,sm0441)；泳道2为pqe80l-blot5未诱导菌体表达产物；泳道3为pqe80l-blot5诱导菌体表达产物；泳道4为pqe80l-blot21未诱导菌体表达产物；泳道5为pqe80l-blot21诱导菌体表达产物；泳道6为pqe80l-blot5-21未诱导菌体表达产物；泳道7为pqe80l-blot5-21诱导菌体表达产物。

图3：重组质粒pqe80l-blot5非诱导菌体表达产物、诱导菌体表达产物、诱导菌体上清液及产物经镍柱纯化后的sds-page电泳图。

图中，泳道1为预染蛋白分子质量标准(fermentas,sm0441)；泳道2为pqe80l-blot5未诱导菌体表达产物；泳道3为pqe80l-blot5诱导菌体表达产物；泳道4为pqe80l-blot5诱导菌体超声破碎上清溶液；泳道5～9为镍柱纯化rblot5蛋白。

图4：重组质粒pqe80l-blot21非诱导菌体表达产物、诱导菌体表达产物、诱导菌体上清液及产物经镍柱纯化后的sds-page电泳图

图中，泳道1为预染蛋白分子质量标准(fermentas,sm0441)；泳道2为pqe80l-blot21未诱导菌体表达产物；泳道3为pqe80l-blot21诱导菌体表达产物；泳道4为pqe80l-blot21诱导菌体超声破碎上清溶液；泳道5～9为镍柱纯化rblot21蛋白。

图5：重组质粒pqe80l-blot5-21非诱导菌体表达产物、诱导菌体表达产物、诱导菌体上清液及产物经镍柱纯化后的sds-page电泳图。

图中，泳道1为预染蛋白分子质量标准(fermentas,sm0441)；泳道2为pqe80l-blot5-21未诱导菌体表达产物；泳道3为pqe80l-blot5-21诱导菌体表达产物；泳道4为pqe80l-blot5-21诱导菌体超声破碎上清溶液；泳道5～9为镍柱纯化rblot5-21蛋白。

图6：westernblotting法检测纯化的rblot5和rblot5-21蛋白。

图中：m为预染蛋白分子质量标准(neb,p7708)；1为纯化rblot5-21蛋白；2为纯化rblot5蛋白。

图7：小鼠血清总ige水平的检测结果统计图。

图8：小鼠体温变化趋势图。

图9：体温变化曲线面积图。

图10：小鼠肺部组织h&e染色结果图。

图11：小鼠肺部组织切片细胞浸润的严重程度打分统计图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本发明做进一步的说明。

实施例1：

热带无爪螨重组变应原blot5-21，该重组变应原通过下述方法制得：

(1)将热带螨blot5基因序列(genbank：u59102)和blot21基因序列(genbank：dq788677.1)融合在一起后进行密码子优化，以达到在大肠杆菌中更好的表达，在优化后的序列两端分别加入bamhⅰ和salⅰ限制性内切酶的酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行全基因合成；

(2)将blot5-21基因序列连接至原核表达载体pqe-80l上，构建pqe80l-blot5-21重组质粒(重组质粒载体示意图见图1)；

(3)将重组质粒pqe80l-blot5-21转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落至10ml含有卡那霉素的lb培养基中，37℃、200r/min振摇8h，按1:100转接培养至od600nm＝0.7，然后利用iptg1mmol/l、37℃诱导4h扩大诱导的菌液量，收集菌体，超声破碎菌体，离心取上清，利用镍柱进行重组蛋白的纯化。纯化方法为：先用1倍柱体积的10mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、10mmol/l咪唑)平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，此步优选重复一次；接着利用3倍柱体积的50mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、50mmol/l咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；最后利用250mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、250mmol/l咪唑)洗脱目的蛋白，每2ml洗脱目的蛋白的流出液储存在一个ep管内，当2ml洗脱液进行洗脱结束后再加入下一个2ml洗脱液。

实施例2：

热带无爪螨重组变应原blot5-21，该重组变应原通过下述方法制得：

(1)将热带螨blot5基因序列(genbank:u59102)和blot21基因序列(genbank：dq788677.1)融合在一起后进行密码子优化，以达到在大肠杆菌中更好的表达，在优化后的序列两端分别加入bamhⅰ和salⅰ限制性内切酶的酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行全基因合成；

(2)将blot5-21基因序列连接至原核表达载体pqe-80l上，构建pqe80l-blot5-21重组质粒(重组质粒载体示意图见图1)；

(3)将重组质粒pqe80l-blot5-21转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落至10ml含有卡那霉素的lb培养基中，37℃、300r/min振摇24h，按1:300转接培养至od600nm＝0.5，利用iptg0.1mmol/l、37℃诱导6h扩大诱导的菌液量，收集菌体，超声破碎菌体，离心取上清，利用镍柱进行重组蛋白的纯化。纯化方法为：先用1倍柱体积的15mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、15mmol/l咪唑)平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，此步优选重复一次；接着利用3倍柱体积的40mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、40mmol/l咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；最后利用300mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、300mmol/l咪唑)洗脱目的蛋白，每2ml洗脱目的蛋白的流出液储存在一个ep管内，当2ml洗脱液进行洗脱结束后再加入下一个2ml洗脱液。

实施例3：

热带无爪螨过敏小鼠模型，通过下述方法建立：

将1mgrblot5-21蛋白作为过敏抗原与50mg氢氧化铝凝胶佐剂混合，室温条件下震荡混合2小时，小鼠腹腔注射100μlrblot5-21/氢氧化铝的复合物，然后利用100μgrblot5-21经过气管注入小鼠的肺组织，进行过敏模型的诱导。

实施例4：

热带无爪螨过敏小鼠模型，通过下述方法建立：

将10mgrblot5-21蛋白作为过敏抗原与500mg氢氧化铝凝胶佐剂混合，室温条件下震荡混合6小时，每只小鼠腹腔注射200μlrblot5-21/氢氧化铝的复合物，然后利用300μgrblot5-21经过气管注入小鼠的肺组织，进行过敏模型的诱导。

实验例1：重组蛋白的原核表达和可溶性表达分析

1)根据实施例1中步骤(2)的方法，分别构建pqe80l-blot5、pqe80l-blot21和pqe80l-blot5-21重组质粒；

2)上述重组质粒构建成功并测序正确后，分别转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落至10ml含有卡那霉素的lb培养基中，37℃、200r/min振摇12h，按1:100转接培养至od600nm＝0.7。取出部分菌液作为非诱导对照，然后加入iptg至终浓度为1mmol/l，37℃诱导6h收样，进行sds-page电泳检测(实验结果见图2)。

结果显示：与非诱导对照相比，经iptg诱导后，重组blot5、重组blot21和重组blot5-21蛋白均呈较好表达。

实验例2：重组蛋白的可溶性表达分析和纯化

取实验例1中的诱导菌液，收集菌体，超声破碎菌体，离心取上清进行sds-page电泳检测(结果见图3至图5)，利用镍柱进行重组蛋白的纯化。纯化方法为：先用1倍柱体积的10mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、10mmol/l咪唑)平衡镍柱，然后将超声破碎离心后的上清液加入镍柱里，此步优选重复一次；接着利用3倍柱体积的50mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、50mmol/l咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白；最后利用250mmol/l咪唑缓冲液(50mmol/lnah2po4、300mmol/lnacl、250mmol/l咪唑)洗脱目的蛋白，每2ml洗脱目的蛋白的流出液储存在一个ep管内，当2ml洗脱液进行洗脱结束后再加入下一个2ml洗脱液，根据洗脱目的蛋白的顺序，依次标记为e1～e5，将e1～e5进行电泳检测(结果如图3至图5的泳道5～9)

结果显示，rblot5-21蛋白几乎全部在上清中存在(图5的泳道4)，表明了rblot5-21蛋白在大肠杆菌内呈现很好的可溶性表达。上清液经过镍柱亲和层析纯化后，在不同的洗脱管内，均有较纯的rblot5-21蛋白(如图5泳道5～9所示)。同样rblot5和rblot21蛋白均有相同结果(如图3、图4所示)。

实验例3：westernblotting法检测纯化rblot5-21蛋白

利用商品化biotin4d9antiblot5抗体(ma-4d9，indoorbiotechnologies)对纯化后的rblot5-21蛋白和rblot5进行westernblotting检测，方法如下：

将纯化的rblot5-21蛋白和rblot5分别进行sds-page电泳，半干法转膜，电压25v，转膜时间为30min；5％的脱脂奶37℃封闭2h，一抗(稀释度：1:5000)室温孵育1h，然后tbst漂洗5次，每次5min；二抗(稀释度：1:5000，羊抗鼠igg-alexafluor488)室温孵育1h，然后tbst漂洗5次，每次5min；typhoonfla9500荧光扫描成像系统进行检测，激发光波长为488nm(实验结果见图6)。

结果显示：在25kda和30kda之间，有明显的阳性条带，表明本发明纯化的重组蛋白大小与rblot5-21一致。

实验例4：重组blot5-21蛋白诱导小鼠过敏模型及检测

将balb/c小鼠随机分成4组：pbs组，rblot5组，rblot21组，rblot5-21组；每组6只小鼠。利用纯化rblot5、rblot21、rblot5-21蛋白进行诱导小鼠过敏模型，pbs组则用等体积的pbs溶液代替，具体实验方法如下：

1)将1mgrblot5-21蛋白(溶于pbs，浓度为1mg/ml)作为过敏抗原与50mg氢氧化铝凝胶佐剂混合，室温条件下震荡混合2小时。第0、7天时，每只小鼠腹腔注射100μlrblot5-21/氢氧化铝的复合物，第14、16、18和20天，利用100μgrblot5-21(溶于pbs，浓度为1mg/ml)经过气管注入小鼠的肺组织，进行过敏模型的诱导。于第21天，眼眶静脉采血；

2)elisa法检测小鼠血清总ige水平：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；待测样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值，根据od值计算小鼠血清总ige浓度(实验结果见图7)；

3)小鼠应激性过敏反应的检测：小鼠尾静脉注射rblot5-21变应原50μg,pbs组注射等体积的pbs溶液。每隔五分钟记录小鼠体温。体温变化曲线所围成面积的统计分析采用one-wayanova，bonferroni’smultiplecomparisonposttests(*,p<0.05；**,p<0.005；***,p<0.0005)(实验结果见图8、图9)；

4)小鼠肺部组织切片h&e染色：小鼠被麻醉处死，取小鼠的肺组织进行固定、包埋和切片，进行h&e(hematoxylinforevaluation)染色。肺部组织切片h&e染色的炎症打分标准：以0-3分标准来评价支气管周围炎症的程度。0分是指没有炎症细胞的侵润；1分是指支气管周围偶尔出现炎症细胞；2分则说明大多数支气管包围着1-5层炎症细胞薄层；3分则代表了大多数支气管周围环绕着一厚层(超过5层细胞厚度)的炎症细胞(实验结果见图10、图11)。

实验结果表明：

a.与pbs组相比，rblot5-21诱导组小鼠血清ige水平显著上升(p<0.005)，rblot5-21诱导后的小鼠呈现出明显的过敏症状；

b.与pbs组相比，rblot5-21诱导组小鼠的体温下降明显，约20min左右，体温下降达到最低，约下降3℃左右，随后小鼠体温又缓慢恢复，约90min左右，体温恢复到低正常体温1℃左右。对小鼠体温变化曲线与y轴0.0处的虚线所围成的面积进行统计，结果如图9所示，与pbs组相比，rblot5-21诱导组显著上升(p<0.0005)；

c.与pbs组相比，rblot5-21诱导组小鼠的肺部细胞侵润显著增多，呈显著差异。

由上述结果可以看出，rblot5-21诱导后的小鼠血清ige上升，肺部组织细胞侵润增加，小鼠的应激性过敏反应更加强烈和敏感，体温下降明显等，这表明了原核表达纯化的rblot5-21具有很强的变应原性，能够诱导小鼠呈现出过敏症状。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。