专利名称：基于全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备方法
技术领域：
本发明属于转基因技术领域，尤其涉及一种基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备及应用。
背景技术：
柑橘全爪螨是一种世界性柑橘害螨，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗性药。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上 取得成功。昆虫几丁质酶参与昆虫(螨类)蜕皮、围食膜降解和防御等重要生命活动。通过柑橘全爪螨几丁质酶基因构建RNA干扰载体，进而获得转基因柑橘材料对柑橘全爪螨进行控制具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备及应用，旨在解决利用RNA干扰技术获得抗虫材料的问题。本发明实施例是这样实现的，一种基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备方法，其特征在于，该制备方法首先从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出2条几丁质酶基因Unigenel0731和Unigene7021，进行真实性检测后，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；设计含有酶切位点的引物，将正、反向多基因几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi干扰载体“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，将载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染。进一步，通过柑橘全爪螨转录组搜索，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；下面为要拼接的Unigenel0731与Unigene7021两个基因序列。进一步，多基因Ug 10731+Ug 7021片段的拼接设计两对拼接引物10731F/10731R，7021 F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物10731R末端与片段ug7021的5，端引物碱基互补。用引物10731F/10731R以ugl0731为模版，退火温度为57度，进行PCR扩增出带有互补序列的ugl0731片段；用引物7021 F/7021R以ug7021为模版，退火温度为57度，PCR扩增出带有互补序列的ug7021片段。胶回收上述两个片段，回收产物按1:1混合后取Iul作为模版，以10731F/7021R为引物，退火温度57度进行第三次PCR，PCR对火过程中两个带有互补序列的片段ugl0731和ug7021将配对形成一条长链，此时得到两个基因连在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通过测序验证序列的正确性，同时为了构建干扰载体，设计引物时在引物10731F和7021R末端分别加了限制性内切酶识别序列。下列为构建的多基因片段，以此设计构建dsRNA。进一步，设计含有酶切位点的引物，将正向多基因片段10731/7021质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物Pl，FlPCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”;将得到的“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”质粒双酶切，同时相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段10731/7021”。进一步，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行分子检测将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异引进行扩增、电泳检测。 本发明应用几丁质酶在昆虫发育过程中的调控作用，通过柑橘全爪螨几丁质酶基因构建RNA干扰载体，最终获得含特异dsRNA的转基因柑橘材料。该转基因材料在生产上的推广应用必将对柑橘全爪螨的控制发挥重要作用，同时减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的市场前景。
图1是现有技术提供的基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备方法的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。图1示出了本发明实施例提供的基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备方法的流程图。该制备方法首先从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出2条几丁质酶基因Unigenel0731和Unigene7021，进行真实性检测后，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；设计含有酶切位点的引物，将正、反向多基因几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi干扰载体“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，将载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染。在本发明实施例中，通过柑橘全爪螨转录组搜索，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；下面为要拼接的Unigenel0731与Unigene7021两个基因序列。
在本发明实施例中，多基因Ug 10731+Ug 7021片段的拼接设计两对拼接引物10731F/10731R，7021 F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物10731R末端与片段ug7021的5，端引物碱基互补。用引物10731F/10731R以ugl0731为模版，退火温度为57度，进行PCR扩增出带有互补序列的ugl0731片段；用引物7021 F/7021R以ug7021为模版，退火温度为57度，PCR扩增出带有互补序列的ug7021片段。胶回收上述两个片段，回收产物按1:1混合后取Iul作为模版，以10731F/7021R为引物，退火温度57度进行第三次PCR，PCR对火过程中两个带有互补序列的片段ugl0731和ug7021将配对形成一条长链，此时得到两个基因连在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通过测序验证序列的正确性，同时为了构建干扰载体，设计引物时在引物10731F和7021R末端分别加了限制性内切酶识别序列。下列为构建的多基因片段，以此设计构建dsRNA。在本发明实施例中，设计含有酶切位点的引物，将正向多基因片段10731/7021质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物Pl，FlPCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”;将得到的“PFGC5941-正 向多基因片段10731/7021”质粒双酶切，同时相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段 10731/7021”。在本发明实施例中，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行分子检测将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异弓I进行扩增、电泳检测。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于柑橘全爪螨几丁质基因的双靶标转基因载体的制备方法，其特征在于， 该制备方法首先从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出2条几丁质酶基因Unigenel0731和 Unigene7021，进行真实性检测后，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与 Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；设计含有酶切位点的引物，将正、反向多基因几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi干扰载体“PFGC+Ugl0731/Ug7021”，将载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过柑橘全爪螨转录组搜索，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigenel0731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因；下面为要拼接的Unigenel0731与Unigene7021两个基因序列。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，多基因Ug10731+Ug 7021片段的拼接 设计两对拼接引物10731F/10731R，7021F/7021R，引物要求使片段ugl0731的3’端引物 10731R末端与片段ug7021的5’端引物碱基互补。用引物10731F/10731R以ugl0731为模版，退火温度为57度，进行PCR扩增出带有互补序列的ugl0731片段；用引物7021F/7021R 以ug7021为模版，退火温度为57度，PCR扩增出带有互补序列的ug7021片段。胶回收上述两个片段，回收产物按1:1混合后取Iul作为模版，以10731F/7021R为引物，退火温度 57度进行第三次PCR，PCR对火过程中两个带有互补序列的片段ugl0731和ug7021将配对形成一条长链，此时得到两个基因连在一起的多基因大片段Ugl0731+Ug7021。通过测序验证序列的正确性，同时为了构建干扰载体，设计引物时在引物10731F和7021R末端分别加了限制性内切酶识别序列。下列为构建的多基因片段，以此设计构建dsRNA。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，设计含有酶切位点的引物，将正向多基因片段10731/7021质粒双酶切，同时将载体PFGC5941质粒用相同两个酶酶切；用T4连接酶将其连接，然后将连接产物转化大肠杆菌，随机挑选单克隆用通用引物Pl，FlPCR检测筛选正确的菌株，提取质粒，然后酶切验证得到“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021” ； 将得到的“PFGC5941-正向多基因片段10731/7021”质粒双酶切，同时相同酶切反向多基因片段10731/7021，T4连接酶连接，转入大肠杆菌随机挑选单克隆，酶切验证，得到 “PFGC5941-正向多基因片段10731/7021+反向多基因片段10731/7021”。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将获得的农杆菌LBA4404菌株侵染外植体，并进行分子检测将准备好的外植体分别置于盛有重组质粒的农杆菌的培养血中，侵染。将上胚轴水平放置于共培养基上，培养箱中培养，取出茎段漂洗，然后水平放于筛选培养基上培养，诱导芽生长直至可以进行嫁接。提取转基因柑橘苗和其阴性对照植株的基因组DNA，并采用基于GUS基因序列的特异引进行扩增、电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种同时应用2种几丁质酶基因的方法。从柑橘全爪螨转录组数据库鉴定出2条几丁质酶基因Unigene10731和Unigene7021，进行真实性检测后，将选出的两个基因在NCBI上进行比对，找出保守序列，根据多基因大片段构建策略将两个基因拼接成一个多基因片段，将Unigene10731与Unigene7021拼接在一起作为一个多基因。设计含有酶切位点的引物，将正、反向多基因几丁质酶目的片段先后插入到载体内含子两端，从而构成反向互补发卡结构的RNAi干扰载体“PFGC+Ug10731/Ug7021”，将载体转载于农杆菌中对柑橘苗木进行侵染。
文档编号C12N15/66GK103014059SQ201210492338
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者冉春, 张云飞, 刘浩强, 陈飞, 李鸿筠, 李俊丽, 李晓姣, 岳建书 申请人:冉春