专利名称：水稻Hd-q基因及其在广适性水稻培育中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及鉴定一个控制水稻基本营养生长期基因的技术以及利用该基因培育地域适应性广的水稻品种的方法。
背景技术：
在全球人口增加和环境恶化等情形下，保证水稻等主要农作物的高产与稳产已经受到越来越多的关注。而通过寻找那些涉及产量和生育期性状的基因已经成为进一步提高作物高产与稳定的最重要的途径之一。水稻的产量性状例如有效穗、穗长、千粒重等一般认为是由大量微效基因协同控制。近年来通过数量性状基因位点和图位克隆等方法，几个控制水稻产量的重要基因相继被克隆，如Ghd7、Gff2, GS3等。但是它们的遗传机制却并不相同，Ghd7主要通 过调控水稻生育期影响产量(Xue 等，NatureGenetics. 2008(6)761-767) ;GS3、GW2 影响谷粒大小和重量(Song 等，NatureGenetics. 2008 (5) 623-630 ；Fan 等，Theor ApplGenet. 2006, (112) : 1164-1171)。因此影响水稻产量的方式是复杂的，不同性状和不同遗传途径都可能影响水稻产量。生育期是水稻重要的农艺性状，直接影响水稻品种的地区适应性和推广潜力。水稻的生育期分为营养生长期、生殖生长期以及成熟期三个阶段。其中成熟期在品种间差异较小，且较稳定。因此现在常用抽穗期的长短来描述生育期的长短。通常认为抽穗期和产量性状紧密联系，因为较迟的抽穗期有着更有效的营养生长，这能生成更多的生物产量(Kawano 等，Japanese journal of breeding. 1968 (18) 46-52)。具有较长基本营养生长期和较弱的光敏感性的水稻品种能够在很大的纬度范围内保持良好的稳定的产量表现。目前已经克隆了多个控制水稻抽穗期的基因，如Hd3a (Kojima等，Plant CellPhysiol. 2002(43):1096-1105),HdlCYano 等，Plant Cell, 2000(12)2473_2483)、Ghd8(Yan等，Molecular Plant. 2011(4) 319-330)、Ghd7 (Xue 等，Nature Genetics. 2008 (6) 761-767)等。而像Ghd7和Ghd8这样的基因在控制生育期的同时还具有影响产量等方面的多效性。Fu等报道，在水稻第I染色体上的0sELF3基因控制着水稻抽穗期，并且也具有多效性(Fu等，Plant Biology，2008，11:751-757)。该基因和拟南芥中的ELF3基因高度同源，而ELF3被认为是控制光信号输入生物节律钟基因，促进拟南芥在长日照开花。最近在水稻第6染色体上也发现了一个ELF3同源基因EF7，并且证实EF7也是控制抽穗期的基因(Yuan等，Theor Appl Genet. 2009 (119) 675-684)，分析该基因位点不同的突变形式(Saito 等，Plant Cell Physiol. 2012 (53) 717-728. Matsubara 等，Plant CellPhysiol. 2012 (53) 709-716)发现其具有不同的等位效应。
发明内容
本发明分离克隆了水稻中一个新的控制水稻基本营养生长期基因Hd-q，该基因来源于籼稻品种清芦占11。在人工控制光照时间长短，同时使水稻处于相同的温度以及肥水条件下，发现含有Hd-q基因的水稻在长或短日照条件下都有延迟抽穗的现象，因此认为该基因对光照不敏感。序列分析发现Hd-q基因是EF7的一个等位变异，由4个外显子组成。与EF7基因比较，Hd-q基因在第二外显子上存在一个特殊的单核苷酸变异位点(下述称为该SNP位点)，具体是在Hd-q基因编码序列第395位的碱基为A，EF7中相应位置是T，结果使Hd-q基因在该位点形成一个终止密码子。Hd-q基因的编码序列如SEQ ID NO. I所示。为了弄清楚该突变位点的效应，申请人以粳稻品种日本晴为受体亲本、清芦占11(含有Hd-q基因)和龙特甫(含有ef7_ltp基因)为供体亲本，将日本晴中的EF7基因分别替换为供体亲本中的Hd-q或ef7_ltp基因，构建了两个近等基因系NIL-Q和NIL_L。Hd-q与其等位基因ef7-ltp相比，只在编码序列第395位点有A和T的差异，而和日本晴中的EF7基因相比有5个位点氨基酸存在差异。保持其他生长条件一致，仅在长日照和短日照下分别观察两个近等基因系及日本晴亲本的抽穗期反应，结果长日照下NIL-L抽穗较日本晴迟，但NIL-Q抽穗更迟，而在短日照下NIL-L和日本晴抽穗期没有显著差异，但NIL-Q抽穗仍然很迟。因此认为，清芦占11中的Hd-q基因可使水稻在长短日照下均能延迟抽穗。
基于上述发现，本发明针对Hd-q与其等位基因EF7或ef7_ltp中编码序列第395位点上碱基A和T的差异，设计了一个衍生的酶切扩增多态性序列(derivedcleavedamplified polymorphic sequences, dCAPS)分子标记 dcapsl 用来筛选含有 Hd_q 基因的水稻植株，可以利用这个标记检测水稻品种中这个特异性位点的分布。该分子标记与导致光不敏感的性状完全连锁，在水稻生长的任何时期任何组织均可对其进行基因型检测。在本发明中，采用简易条件下通过PCR-酶切法鉴定水稻植株中EF7基因上该位点碱基是T还是A，所用限制性内切酶为Hpal。将该SNP位点是碱基T的水稻品种基因型标记为TT型，是碱基A的水稻品种的基因型标记为AA型。在严谨条件下通过PCR-测序法鉴定，即将该PCR扩增片段克隆到测序质粒载体上进行序列测定，从而判断突变位点是何种碱基。本发明还公开了种鉴定Hd-q基因的方法，是以水稻DNA为模板，利用dcapsl标记引物进行PCR扩增，用限制性内切酶HpaI消化PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察DNA条带的大小来鉴定Hd-q基因，有大小为129bp条带的为Hd_q基因；其中所述dcapsl标记引物的序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。上述水稻基因Hchq能用于培育对光照不敏感的水稻品种。本发明也提供了一种提高水稻地域适应性的方法，利用中dcapsl标记引物进行辅助选择、结合常规杂交和回交方法Hd-q基因片段导入到目标品种中。利用分子标记dcapsl辅助选择进行回交选育将光照不敏感基因Hd-q导入水稻品种，使其在不同光照条件下都有一个延长了的营养生长期，从而提高该水稻植株的地域适应能力，最终选育出广适性的水稻品种。本发明中将Hd-q基因导入日本晴品种选育出一个在长或短日照下均能延迟抽穗且有着良好产量性状表现的改良系，该改良系在保持原品种其他优良性状的同时，适当延长了生育期，增加了前期营养积累，增产潜力明显。
图I是Hd-q基因和EF7基因编码序列第395位及附近的碱基序列。其中Hd_q基因(AA基因型)在第395位碱基为A，而EF7基因(TT基因型)上该位置碱基为T。在该突变位置及附近设计一个dCAPS分子标记dcapsl (下划线为上下游引物的位置)。利用该分子标记从水稻总DNA中经PCR扩增出DNA产物，含TT基因型的产物可以被限制性内切酶HpaI识别并切割，而AA基因型的产物不能被HpaI切割。图2是利用分子标记dcapsl检测不同基因型水稻品种，PCR产物经HpaI酶切后的电泳示意图。下侧为电泳起始点，泳道1-6为日本晴(TT基因型)PCR产物经酶切后的电泳谱带(大小为22bp谱带因太小而不可见)，泳道7-10为清芦占11 (AA基因型)PCR产物经酶切后的电泳谱带。图3是日本晴及经dcapsl分子标记辅助选择育成的改良系水稻植株形态特征图及生育期和主要产量性状比较。
具体实施例方式通过以下实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中 涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。实施例lHd-q基因的克隆与功能验证在前期研究中，我们以粳稻品种日本晴为受体亲本，籼稻品种清芦占11和龙特甫(由中国农科院作物科学研究所提供，详见中国作物种质信息网http://icgr. caas. net.cn/)等为供体亲本，构建了一系列染色体片段替换系。在以清芦占11为供体的后代中发现了一个替换系C63，该系在扬州夏季长日照条件或海南冬季短日照条件下都表现为延迟抽穗现象。将C63与日本晴杂交，得到Fl杂合植株，Fl植株表现为正常抽穗。对来源于Fl植株的F2分离群体进行遗传分析并初定位该基因，从F2群体中随机选取部分植株，发现早抽穗植株迟抽穗植株符合3:1的分离比例，表明该片段替换系含有一个控制迟抽穗的隐性基因。利用F3群体中的一些关键的植株将目的基因精细定位在43. 7kb的区域内。根据水稻全基因组序列数据库(The TIGR Rice Genome Annotation Project website)分析该区域发现在这个区域内存在7个预测基因，其中L0C_0s06g05060与拟南芥中已报道的基因ELF3高度同源。在水稻中有报道称，该基因参与控制水稻生育期，命名为EF7(Yuan等，Theor Appl Genet. 2009 (119) 675-684)。初步认为该片段替换系C63中控制迟抽穗的基因是EF7的等位基因，命名为Hd-q。在此基础上，我们通过互补实验验证该染色体片段替换系C63中控制生育期的基因是否是L0C_0s06g05060基因。首先根据水稻全基因组序列数据库中提供的EF7基因相关区域序列信息，选取包括EF7基因及上游2Kb左右全序列，设计特异性引物以水稻品种日本晴的基因组DNA为模板进行PCR扩增；然后将得到的DNA片段连接测序载体，确认无误后将该DNA片段酶切并与载体pCAMBIA1300 (由澳大利亚CAMBIA的Jefferson教授提供，详见WWW. cambia. org)片段进行连接,得到重组质粒pCAM1300_EF7 ;通过农杆菌介导的方法(刘巧泉等，植物生理学报1998(24)259-271)将EF7基因导入水稻染色体片段替换系C63。将转基因植株种于大田并对抽穗期进行观察调查，发现其中多个转基因植株的抽穗期提早，与日本晴相似。据此，判断Hd-q基因即为EF7基因(L0C_0s06g05060基因)的等位基因。序列分析发现Hd-q基因是EF7的一个等位变异，由4个外显子组成。与EF7基因比较，Hd-q基因在第二外显子上存在一个特殊的单核苷酸变异位点(下述称为该SNP位点)，具体是在Hd-q基因编码序列第395位的碱基为A，EF7中相应位置是T (图1)，结果使Hd-q基因在该位点形成一个终止密码子。为了弄清楚该突变位点的效应，以粳稻品种日本晴为受体亲本、清芦占11 (含有Hd-q基因)和龙特浦(含有ef7_2基因)为供体亲本，将日本晴中的EF7基因分别替换为供体亲本中的Hd-q或ef7_2基因，构建了两个近等基因系NIL-Q和NIL-L。ef7_l与其等位基因ef7-2相比，只在编码序列第395位点有A和T的差异，而和日本晴中的EF7基因相比有5个位点氨基酸存在差异。保持其他生长条件一致，仅在长日照和短日照下分别观察两个近等基因系及日本晴亲本的抽穗期反应，结果长日照下NIL-L抽穗较日本晴迟，但NIL-Q抽穗更迟，而在短日照下NIL-L和日本晴抽穗期没有显著差异，但NIL-Q抽穗仍然很迟。因此认为，清芦占11中的Hd-q基因可使水稻在长或短日照条件下均能延迟抽穗。实施例2dcapsl分子标记的设计与检测根据实施例1，与EF7基因比较，Hd-q基因在第二外显子上存在一个特殊的单核 苷酸变异位点(下述称为该SNP位点)，具体是在Hd-q基因编码序列第395位的碱基为A，EF7中相应位置是T，结果使Hd-q基因在该位点形成一个终止密码子。根据这个SNP设计特异性的dCAPS标记dcapsl (上游引物dcapsl-FSEQ ID NO. 2和下游引物dcapsl-R SEQID NO. 3)用来寻找验证这个特殊位点(图1)，所用限制性内切酶HpaI能够识别在该SNP位点为T的基因型的水稻(如日本晴，称为TT基因型)，而不能识别突变为碱基A的基因型的水稻(如清芦占11，称为AA基因型)。用引物dcapsl对水稻总DNA进行PCR扩增，得到DNA片段大小为129bp，用限制性内切酶HpaI酶切PCR扩增产物，然后用3%的琼脂糖凝胶电泳分离(图2)。如果经电泳后分为107bp和22bp两个大小不同的片段，说明待检测检测水稻植株的基因型为TT型；如果电泳后的谱带大小在129bp位置，则可推测待的水稻植株的基因型为AA型(图2)。在严谨条件下通过PCR-测序法鉴定，即将该PCR扩增片段克隆到测序质粒载体上进行序列测定，从而确定突变位点是何种碱基。图2是利用分子标记dcapsl检测不同基因型水稻品种、PCR产物经HpaI酶切后的电泳示意图。泳道1-6为若干TT基因型水稻品种107bp谱带，泳道7-10为AA基因型品种129bp谱带。实施例3分子标记辅助选育含Hchq基因的水稻新品系本发明提供一种思路以含有Hd-q基因的水稻植株(如水稻品种清芦占11)为供体亲本，以待改良的水稻品种或品系(如日本晴)为轮回亲本，进行连续回交选育。在低世代用实施例2中的与目标基因Hd-q基因及其延迟抽穗的目标性状相连锁的分子标记dcapsl进行辅助选择，在高世代群体中可结合抽穗期表型加以选择，经过一定的世代后可以选育出既保留原来待改良亲本优良的性状，又具有良好地域适应能力的新品种或新品系。本发明通过将Hd-q基因导入一个已经完成全基因组测序的粳稻品种日本晴。具体以清芦占11 (含Hchq基因的籼稻品种)为供体亲本，以日本晴为受体亲本。经过杂交、回交，结合分子标记辅助选择，选出了一个近乎只含有Hd-q基因供体片段的改良系(图3)。通过分子标记背景检测(Zhang等，J GenetGenomics. 2011 (38)603-611),证明该改良系遗传背景与日本晴基本一致，只在第6染色体末端含有一个较小的供体片段，片段大小约100Kb，其中含有来自清芦占11的Hd-q基因。在扬州夏季自然光照条件下(长日照条件)，对改良新品系的农艺性状进行了调查，抽穗期较日本晴延迟了 18天(图3)，株高、茎杆直径、千粒重等主要农艺性状比日本晴对照有明显改良，而其它性状变化不大。在海南陵水冬季自然光照条件下(短日照条件)，改 良新品系的抽穗期较日本晴延迟了 16天(图3)、株高、茎杆直径、每穗粒数、结实率比日本晴均有极显著提高(图3)。表明不管在长日照还是短日照条件下，含Hd-q基因的改良新品系的生育期均能够比日本晴有适当延长，并且有明显的增加产量的潜力，能够显著提高原品种的地域适应能力。
权利要求
1.一种水稻@7基因的等位基因其特征在于，它是在@7基因的编码序列第395位的碱基发生了由T到A的突变，形成终止密码子，故Z-^7基因的编码序列如SEQ ID NO. I所/Jn o
2.一种鉴定故/-^基因的方法，其特征在于以水稻DNA为模板，利用dcapsl标记引物进行PCR扩增，用限制性内切酶///Ml消化PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳后在紫外光下观察DNA条带的大小来鉴定故基因，有条带大小为129bp的为故/-^基因；其中所述dcapsl标记引物的序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
3.权利要求I所述水稻基因Zfeh7在培育对光照不敏感水稻品种中的应用。
4.一种培育对光照不敏感、适应性广的水稻的方法，其特征在于，该方法是利用权利要求2中dcapsl标记引物进行辅助选择、结合常规杂交和回交方法将权利要求I所述的 基因片段导入到目标品种中。
全文摘要
本发明公开了一种控制水稻基本营养生长期的基因Hd-q以及利用该基因培育地域适应性广的水稻品种的方法。Hd-q基因是水稻EF7基因的一个新的等位基因，它含有一个特殊的单核苷酸变异位点，使得含有Hd-q等位基因的水稻品种对光照不敏感、适用性广。该生育期基因Hd-q编码序列与EF7基因相比，其特征在于，它在第395位的碱基发生了由T到A的突变，形成终止密码子。根据这个T/A单碱基变异，设计特异性的dCAPS标记用来鉴定Hd-q基因，进而利用这个标记辅助选择、结合常规杂交和回交方法将Hd-q基因导入目标品种中，培育对光照不敏感、适应性广的水稻新品种。
文档编号C12Q1/68GK102965381SQ20121049226
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者刘巧泉, 赵冬生, 张昌泉, 顾铭洪 申请人:扬州大学