专利名称：：鱼用多效价活疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及疫苗
技术领域：
，特别涉及鱼用细菌性载体活疫苗
技术领域：
，具体是指一种抗迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的载体活疫苗相关制剂及应用。
背景技术：
：鉴于世界人口的不断增长及天然渔业资源的日益枯竭，水产业作为一种传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。据统计，2002年我国水产品总量占全球总产量的71%和总产值的49.8%，居世界第一位。据FAO统计，2004年我国的水产产品总量达4750万吨。然而，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度研制模式逐渐成为我国鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。作为世界上的水产养殖大国，我国的海水养殖品出口量只占到了养殖总量的6%左右，一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年我国水产品出口因质量安全问题受到欧盟、日本等国家和地区的限制。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验(OrmondeP.Fisheriesresources:trendsinproduction,utilizationandtrade.1n:NomuraI(ed.).TheStateofWorldFisheryandAgriculture2002.Rome:FAOInformationDivision,2002,p3p45),倡导“系统管理途径”(Systemmanagementapproaches,SMA)养殖模式防治各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Killvaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能为水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。近年来，随着对病原基因背景的深入了解及重组DNA技术的不断发展，将编码某一特定病原体蛋白的外源基因插入无毒力病毒或者细菌疫苗株的基因组的某一部位，使其高效表达，但不影响疫苗株的正常生长与繁殖。用这种重组体作为活疫苗进行接种时，病毒或细菌能产生特定的外源蛋白，并诱发机体产生特异性免疫应答。目前，这种能针对多种病毒病害的多效价疫苗也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。其中，利用高效信号肽分泌表达外源病原蛋白已成为多效价疫苗开发中的一种重要技术手段，并且该技术已在大肠杆菌及沙门氏菌的疫苗开发中得到了成功应用(GentschevI，etal.TheE.colia-hemolysinsecretionsystemanditsuseinvaccinedevelopment.TrendsMicrobiol，2002(10):39-45及RussmannHjetal.DeliveryofepitopesbytheSalmonellatypeIIIsecretionsystemforvaccinedevelopment.Science,1998(281):565-568)，但在迟钝爱德华氏菌疫苗的研制中还未见相关技术应用的报道。爱德华氏菌属是导致淡水、海水养殖鱼类细菌性疾病的一类常见的病原体，具体分为迟纯爱德华氏菌(Edwardsiellatarda),鱼爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)和保科爱德华氏菌(Edwardsiellahoshinae)。由其引起的鱼类出血性败血症统称为爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)。该病传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲤鱼，罗非鱼，鳗鲡，鲻鱼，鲑鱼，鳟鱼，鲆鲽等大多数具有较高经济价值的鱼种。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。美国专利有利用利福平筛选得到野生毒株的自然减毒突变体作为减毒活疫苗的报道(EvansJJ,Klesius,PHandShoemakerCA2006ModifiedIiveEdwardsiellatardavaccineforaquaticanimals;UnitedStatesPatent7067122)。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。淡水、海水养殖业需要更有效的鱼用疫苗，尤其是能同时抵抗多种病原菌侵害多效价鱼用活疫苗。这样的多效价鱼用活疫苗具有非常重要的经济价值。
发明内容本发明提供一种赋予疫苗株抗迟钝爱德华氏菌和抗嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)多效价抗性的重组载体,具有多效价抗性的载体活疫苗及它们的应用。本发明的重组载体或多效价活疫苗设计独特巧妙，与传统疫苗相比具有免疫保护效果更好的特点，使用简便、安全、费用低廉，为防治养殖鱼类的疾病提供一种安全、有效、经济的疫苗，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。本
发明内容之一是一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。实施方式之一中，所述重组表达载体是以pUTt为起始载体构建而成。实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌Tat信号肽是氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽。实施方式之一中，二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽的编码序列如SEQIDN0:2所/Jnο实施方式之一中，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如GenbankHQ697336所不。实施方式之一中，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码序列如SEQIDNO:3所示实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps序列如SEQIDNO:4所示。本发明的内容还包括一种含有本发明的重组表达载体的迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株。实施方式之一中，所述多效价活疫苗株为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301，其保藏号为:CCTCCN0:M2012324。本发明的内容还包括本发明重组载体或本发明疫苗株用于制造鱼用药物的用途，所述药物用于防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染。本发明的有益效果包括但不限于1.本发明的迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株是在减毒活疫苗的基础上构建的表达异源蛋白的载体活疫苗，相对于其野生毒株EIB202具有明显的低毒性，免疫效果显著，可有效地保护鱼类免受迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的侵害，具有非常好的水产养殖中爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病的防治效果；2.本发明的迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性，有实际的商业开发应用价值；3.本发明的迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株为载体活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。图1是本发明重组载体实施方式之一pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA的结构图谱。其中，rrnBTlT2为强终止子，GapA表示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码区，ssDmsA为二甲基亚砜还原酶A亚基(DmsA)信号肽编码区，Pdps为dps启动子，pBR322_origin为复制区，Ampr为编码氨苄青霉素抗性基因区，EcoR1、BamH1、HindIII为对应的酶切位点。图2是Westernblotting法检测本发明实施例中构建的E.tardaWED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA菌株胞质、周质、胞外组分GapA定位情况。图3是本发明疫苗株实施方式之一DmsA-GA对大菱鲆(Scophtalmusmaximus)的免疫保护率，以迟钝爱德华氏菌WEB疫苗株或无菌生理盐水为对照。其中，A:免疫4周后用迟钝爱德华氏菌EIB202和嗜水气单胞菌LSA34联合攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率:免疫4周后用迟钝爱德华氏菌EIB202攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率；C:免疫4周后用嗜水气单胞菌LSA34攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率。具体实施例方式本发明构建了一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps(简称Pdps)、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)编码序列对于用来构建本发明重组表达载体的起始载体，本发明没有特别限制，只要能够在在迟钝爱德华氏菌内存活和/或复制即可。本领域技术人员可以根据转化的对象和转化目的，例如是为表达、扩增还是整合到基因组等，依照现有技术的教导做出合适的选择。例如，可以选用质粒载体，例如后文实施例所用的pUTt质粒。迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps，在此简称Pdps，控制目的基因的启动表达。本发明实施方式之一中，迟钝爱德华氏菌Pdps来自保藏号CCTCCN0:M208068的迟钝爱德华氏菌EIB202，其序列如SEQIDN0:4所示。本发明选用高效的迟钝爱德华氏菌Tat信号肽构建本发明的重组载体。所述信号肽的作用在于介导所述3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)的分泌和细胞定位。本发明实施方式之一选用迟钝爱德华氏菌双精氨酸运输系统底物二甲基亚砜还原酶A亚基(DmsA)信号肽(简称ssDmsA)构建得到重组质粒pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。用该质粒转化迟钝爱德华氏菌构建得到本发明的载体活疫苗株。实施方式之一中，用该载体转化减毒迟钝爱德华氏菌毒株WED,得到多效价载体活疫苗，以E.tardaffED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA表示,简写为DmsA-GA0据信，嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)对鱼类具有良好的免疫保护效果。本发明实施方式之一中，采用嗜水气单胞菌LSA34的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)，其氨基酸序列如GenebankHQ697336所示。本发明中，“操作性相连”的序列包括与感兴趣的基因毗连或相距一定距离的表达调控序列，该操作性连接方式使得所述调控序列能够控制感兴趣基因的表达，使得其中宿主细胞内得以转录和表达。本发明重组载体的构建采用常规重组技术。例如，方法之一包括克隆出具有酶切位点的3-磷酸甘油醛脱氢酶的核苷酸序列；酶切3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸和起始载体；连接酶切的编码3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸和载体，构成中间质粒；构建具有酶切位点的启动子-信号肽融合基因；酶切启动子-信号肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸的中间质粒；连接酶切的启动子-信号肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列的载体，得到本发明的重组表达载体。构建方法没有顺序依赖性。可以先将3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸构建入载体，再将启动子-信号肽融合基因构建入载体。也可以先把启动子-信号肽的融合基因构建入载体，再将3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸构建入载体。还可以先将启动子-信号肽融合基因与3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸连接，然后将此连接产物构建入载体。这些过程本领域技术人员可以根据其掌握的技术结合合适的酶切位点即可完成。本发明还提供一种迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株，其中含有本发明的重组表达载体。本发明的“多效价”活疫苗能够提供对多种鱼类致病菌的对免疫保护功效，尤其是对于钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌感染的免疫保护。本发明实施方式之一是命名为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301的多效价载体活疫苗株，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2012324。本发明的内容还包括采用本发明重组载体或本发明多效价疫苗防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染的方法以及该方法所用的药物。实施方式之一中，本发明提供了一种迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株的制剂，其中包含本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株和在药理上可接受的载体。实施方式之一，所述载体活疫苗株的菌体细胞浓度数量级为IO2109CFU/ml，或者IO6109CFU/ml。实施方式之一中，所述载体是无菌生理盐水，例如NaC19g/L，pH为7.2的生理盐水。本发明的内容还包括采用本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体、活疫苗株或本发明多效价载体活疫苗株制剂防治养殖鱼类的迟钝爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病中的方法。实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株或所述制剂通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度数量级为IO2109CFU/ml，或者IO6109CFU/ml。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本申请的保护范围。实施例材料与方法pUTt质粒发表于XiaoY,LiuQ,ChenH,ZhangY.AstableplasmidsystemforheterologousantigenexpressioninattenuatedVibrioanguillarum.Vaccine.2011,29(40):6986-6993。申请人保证从本申请申请日起二十年内向公众按需要发放该生物材料。EscherichiacoliToplOF，购自Invitrogen。E.coliBL21(GapA)菌株发表于X.Li,H.Wu,M.Zhang,S.Liang,J.Xiao,Q.Wang,Q.LiuandY.Zhang.Secretedglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseasabroadspectrumvaccinecandidateagainstmicrobialinfectioninaquaculture.LettApplMicrobiol,2011，54:1-9。申请人保证从本申请申请日起二十年内向公众按需要发放该生物材料。迟钝爱德华氏菌毒株EIB202:已于2008年5月I日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:M208068。该菌株的相关记载另可见于“IsolationandidentificationoffishpathogenEdwardsiellatardafrommaricultureinChina，，，肖婧凡等，《AquacultureResearch》，Vol.40,2009。嗜水气单胞菌LSA34:已于2009年6月10日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:M209124。该菌株的相关记载另可见于中国专利公开CN101659958(申请号CN200910054113.9)。迟钝爱德华氏菌减毒株WED:已于2010年10月24日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:M2010278o该菌株的相关记载另可见于中国专利申请公开CN101974472A。迟钝爱德华氏菌载EIBAV12090301:已于2012年9月3日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:M2012324o培养基与生理盐水组成LB液体培养基胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaC15g/L，ρΗ7·5LB斜面培养基胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaC15g/L，琼脂18g/L，pH7.5，氨苄青霉素100μg/ml；种子培养基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,pH7.5，氨节青霉素100μg/ml；发酵培养基胰蛋白胨(Difco)10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L,NaC15g/L,ρΗ6·8，氨节青霉素100μg/ml；生理盐水NaC19g/L，pH7.2，121°C灭菌20分钟。以下例实施例中，除非特别说明，所涉方法、操作或步骤皆按照本领域常识、常规中常用条件下据信，例如《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratorePress,1989)中所述或厂商推荐的条件或流程。实施例1重组表达载体的构建构建重组表达载体pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。(一)PCR扩增获得所需基因片段以迟钝爱德华氏菌EIB202的基因组为模版，利用下列扩增引物进行PCR获得Pdps-ssDmsA融合片段。Pdps-ssDmsA-PlCCGGAATTCGCCGCATCAGCGCTGAAAAAAAC,SEQIDNO:5Pdps-ssDmsA-P2CTGTTTTTTTTCATTCTGCATGCTCTCCTTGG,SEQIDNO:6Pdps-ssDmsA-P3GGAGAGCATGCAGAATGAAAAAAAACAGTCGG,SEQIDNO:7Pdps-ssDmsA-P4CGGGATCCCTTATTCTGCGCGGGCGTAG,SEQIDNO:8下划线所示为酶切位点。首先分别用Pdps-ssDmsA-Pl和Pdps-ssDmsA_P2,Pdps-ssDmsA_P3和Pdps-ssDmsA_P4扩增获得OverlapPCR所需的上下游片段Pdps,ssDmsA。回收各片段后，利用OverlapPCR技术米用Pdps-ssDmsA-Pl和Pdps-ssDmsA_P4获得Pdps-ssDmsA融合片段。以嗜水气单胞菌LSA34的基因组为模版，利用扩增引物GapA-F和GapA-R扩增得至IJGapA片段。权利要求1.一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。2.如权利要求1所述的重组表达载体,是以PUTt为起始载体构建而成。3.如权利要求1所述的重组表达载体，所述迟钝爱德华氏菌Tat信号肽是氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽。4.如权利要求3所述的重组表达载体，二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽的编码序列如SEQIDNO:2所示。5.如权利要求1所述的重组表达载体，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如GenbankHQ697336所不。6.如权利要求1所述的重组表达载体，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码序列如SEQIDN0:3所示。7.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps序列如SEQIDN0:4所示。8.—种迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株，含有以上权利要求中任一项所述的重组表达载体。9.如权利要求8所述的疫苗株，命名为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301，其保藏号为CCTCCN0:M2012324。10.权利要求1至7中任一项所述重组表达载体或权利要求8或9所述疫苗株用于制造鱼用药物的用途，所述药物用于防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染。全文摘要本发明涉及一种鱼用多效价活疫苗及其应用。所述疫苗包含一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。文档编号C12N1/21GK103014051SQ20121049231公开日2013年4月3日申请日期2012年11月27日优先权日2012年11月27日发明者王启要,王亚敏,刘琴,吴海珍,肖婧凡,张元兴申请人:华东理工大学