红平红球菌几丁质脱乙酰基酶及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体的说是一种红平红球菌几丁质脱乙酰基酶及 其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 几丁质（chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以0-1，4糖苷键连接而成的多聚体，是 天然多糖中十分重要的一类，其数量仅次于世界上资源最丰富的纤维素，但其利用价值比 纤维素更高，是自然界中数量第二多的的含氮类有机化合物，被欧美学术界称为世界第六 生命要素。很多类似于虾蟹等节肢动物的外壳里都存在几丁质；像昆虫、动物体表及消化道 里也含有丰富的几丁质。
[0003] 据估计，自然界中的几丁质生物合成量超过1000亿吨，而人类每年所需几丁质的 量也高达3. 7X 104吨，主要是海洋动物产品加工的废弃物。另外，海洋中产生的大量废弃 物中，几丁质将近一亿吨，而且海洋生物圈中产生的几丁质占全球几丁质总量的绝大部分， 可以说是一种取之不尽的生物宝库。
[0004] 而壳聚糖(脱乙酰甲壳素，chitosan)是几丁质的一类最重要的衍生物，也是自然 存在的唯一一种碱性多糖，可以应用于食品、化妆品、纺织、医疗、印染、保健、废水处理等许 多领域，其利用价值很高，是市场推广和产品研发的有力组成部分。
[0005] 目前工业上生产壳聚糖普便采用强碱热化学法，该方法生产壳聚糖存在较多的缺 陷和不足，主要包括以下几方面：生产过程耗能大、消耗大量强碱，严重污染环境，不能获得 质量均一、具有特定脱乙酰度的壳聚糖等。几丁质脱乙酰酶能够催化几丁质生成壳聚糖，具 有工艺条件温和、环境友好、产品质量高等优点。采用几丁质脱乙酰酶生产壳聚糖则可以解 决强碱热化学法制备壳寡糖的诸多缺陷和不足，生产出质量均一、性能稳定的壳聚糖，满足 生物医学等领域对壳聚糖的高质量要求。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种红平红球菌几丁质脱乙酰基酶及其构建方法和应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] 一种红平红球菌几丁质脱乙酰基酶，红平红球菌（Rhodococcus erythropolis HG05)几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA)氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示，或 者
[0009] 在SEQ ID NO. 2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基 酸且仍具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID N0. 2衍生出来的蛋白质。
[0010] 所述红平红球菌几丁质脱乙酰基酶编码的基因核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 红平红球菌几丁质脱乙酰基酶的构建方法：
[0012] 1)构建 RhErCDA 重组表达载体质粒 pCT7-CHISP6H-RhErCDA ;
[0013] 2)将步骤1)所得重组表达载体质粒导入大肠杆菌宿主细胞（BL21 (DE3))，进行诱 导表达，获得表达产物；
[0014] 3)以金属螯合层析柱分离纯化步骤2)所得到的重组蛋白，即SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重组几丁质脱乙酰基酶；或者
[0015] 在SEQ ID N0. 2中限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或者几个氨基 酸且仍具有几丁质脱乙酰基酶活性的由SEQ ID N0. 2衍生出来的蛋白质。
[0016] 所述步骤3)中以金属螯合层析柱一步法纯化获得电泳纯的SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重组RhErCDA。
[0017] 红平红球菌几丁质脱乙酰基酶（RhErCDA)的应用，所述重组RhErCDA可用于制备 壳聚糖。
[0018] 本发明所具有的优点：本发明获得了红平红球菌几丁质脱乙酰基酶RhErCDA基 因序列，并在大肠杆菌中实现其高效分泌表达以及一步法纯化重组RhErCDA。所得重组 RhErCDA的脱乙酰基活性，为酶法制备壳聚糖工艺的开发与应用提供了基础。具体的说本发 明重组RhErCDA的获得对几丁质资源的深度开发与高值化利用具有重要的理论意义和实 践意义。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例提供的RhErCDA基因推导的氨基酸序列特征。
[0020] 图2为本发明实施例提供的诱导表达的重组RhErCDA酶解实验结果，其中，A为未 涂布重组RhErCDA室温放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固体平板；B为涂布重组RhErCDA室 温放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固体平板。
[0021] 图3为本发明实施例提供的分离纯化的重组RhErCDA的SDS-PAGE分析结果图，其 中，M为蛋白标准分子量；P为咪唑洗脱样品。
【具体实施方式】
[0022] 下面实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0023] 实施例1 :红平红球菌几丁质脱乙酰基酶基因的克隆
[0024] 以NCBI中提供的4个R. erythropolis全基因组序列中注释为几丁质脱乙酰基酶 (chitin deacetylase，CDA)的序列信息设计引物用于扩增R.erythropolis HG05的几丁 质脱乙醜基酶基因。引物具体为：
[0025] RhErCDA-dF ：ATGGACCGCCGACGCTTCCTC
[0026] RhErCDA-dR : TCACGGCTTCAGATARACAT (R 代表 A/G)
[0027] 以菌体 R. erythropolis HG05 作为模板（R. erythropolis HG05 为红平红球菌 (Rhodococcus erythropolis),并利用响应面分析的方法对其产酶条件进行了优化（Sun YY，Zhang JQ, Wu SJ, Wang SJ. Statistical optimization for production of chitin deacetylase from Rhodococcus erythropolis HG05. Carbohydrate Polymers, http:// dx. doi. org/10. 1016/j. carbpol. 2013. 11. 010)〇 )〇
[0028] PCR 的反应体系为：模板 1 u L ;5u L10XPCR buffer，2u L dNTP(10mmol/L)，2u L 引物 RhErCDA-dF (10 u mol/L)，2 u L 引物 RhErCDA-dR (10 u mol/L)，1 U L Taq DNA 聚合酶 (5U/u L)，加 ddH20 补至体积 50 u L。PCR 反应条件：95t：预变性 5min ;95t：变性 30s，55DC 退火30s，72°C延伸2min，30个循环；72°C延伸lOmin。利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩 增产物进行电泳分析，将PCR产物切胶，利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，回收PCR产物连 接PMD19-T载体(按照使用说明书进行)，16°C连接30min。将连接产物（pMD19-RhErCDA)转 化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布含有l〇〇ii g/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37°C培养 过夜，以M13-F/M13-R为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测 阳性克隆摇囷后进彳丁 DNA测序。测序结果如SEQ ID NO. 1中喊基序列所不：
[0029] ATGGACCGCCGACGCTTCCTCAGTGCCCTCGCAGCAGCAACTCTGACCGGAACCGCCGCGGTGACCATG GGAACCGCTTGTTCGTCACGTTCGGTCGGCACGGCAATCGCCGCAGCCGACGAACCAACCGACCCCGTCCCGGTCCC GGATCTCCCGCCTGCCTTGTTGCCGCCTCCACCGCCGTCTGCCCGGGTGCCGCTGCCCGCCGGCGGATCGTTGACCG CGTTACCCGGCGGTGGGGATCTGTTTGCCCTGACGGTTGACGACGGAGCCAGCTCCGAAGTCGTGCGCCTCTACACA CAGTTCGCAAAAGACACCGGCATCCGTTTGACGTACTTCGTAAACGGGCAATACAACTCGTGGACCGAAAACGCCGG ACTTCTCAGACCGCTGGTCGAGAGCGGACAAATTCAGCTCGGCAATCACACCTAC