专利名称：一种用毕赤甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法
技术领域：
本发明涉及用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法。
背景技术：
乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)，1960年从牛乳中分离获得，它是一种铁结合性糖蛋白，分子量80KDa左右，LF具有转运铁离子和杀菌抗病毒的功效，它在乳腺中的表达量最高，而且以人乳中的含量最高，牛乳中的含量相对较少。其独特的作用机理引起人们的高度重视，并将其从牛奶中分离纯化后加入婴儿奶粉。乳铁蛋白肽(Lactoferricin，简称Lfcin)是乳铁蛋白在动物消化道内经蛋白酶降解后的产物，其某些生物学活性比乳铁蛋白还要强。天然LF具有广泛的生物学功能，特别是在抑菌，抗菌杀菌，抗病毒，调节机体免疫反应等方面都有相关报道，但LF在动物机体上的作用报道却较少。从乳中提取天然的LF，方法复杂，纯度不高，导致LF价格昂贵。在畜牧生长中，由于抗生素的大量超量使用，耐药菌株的出现，药物的残留，环境的污染，已成为当前人们普遍关心的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组乳铁蛋白及其肽的方法。
本发明用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组乳铁蛋白及其肽的方法包括以下步骤(1)取母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到乳铁蛋白或乳铁蛋白肽的cDNA，根据乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆；(2)重组酵母表达载体的构建与鉴定将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化，将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的转移载体，得到含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因的重组转移载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含Amp的LB平板上，培养过夜随即挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切及PCR鉴定；(3)重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16线性化重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂75.0μl重组表达载体，终浓度达1.0μg/μL；3～5μL线性化酶，20.0μL缓冲液；轻轻混匀，37℃下放置12～16小时；在此期间根据Invitrogen Pichia Expression Kit进行酵母菌PMAD11或PMAD16感受态的制备，取出100μL与1～3μg上述线性化的重组表达质粒混合液，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，于Bio Rad Gene Pulser电转仪在750V，25μF，∞Ω条件下电转化后，立即加入1mlYPAD在28～30℃静止培养1小时，1500g室温离心3分钟，小心倒净上清，沉淀重悬于100μL的1×YNB，取50μL菌液涂布于MD选择平板上，于28～30℃条件孵育3～4天，观察转化子的生长；(4)Ade+Muts表型转化子的筛选检测将转化菌落分别对应地点在MM和MD选择平板上，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的菌株；接种单菌落于5mlYPD液体培养基中，28～30℃培养16～20小时后离心，收集菌体，用玻璃珠法提取酵母基因组，并以提取的酵母基因组DNA作模板，用酵母载体上通用的引物进行PCR反应，反应条件如下94C预变性2分钟，94℃50s，55℃50s，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；两个引物分别为α-Factor5-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3和3′AOXIGAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3′.
(5)Ade+Mut8菌株的诱导表达接单菌落于10～50mlBMDY液体培养基中，28～30℃培养16-18个小时，培养至0D600＝2.0～10，离心收集菌体，用5mlBMMY培养基重悬，在28～30℃，255rpm进行培养4天，在诱导过程中，每24小时加1次甲醇，终浓度为0.5％，在0，24，36，72，96小时等时间点取500μL发酵液，离心菌体，用10％SDS-PAGE分析产物；(6)目的蛋白的纯化与鉴定表达上清过滤除去菌体残渣，于4℃用终浓度70％的硫酸铵沉淀，10000rpm离心15分钟收集沉淀，用浓度为10mmol/L、PH7.4的磷酸缓冲液溶解，用10mmol/L的PBS透析24小时，期间换透析液3次；上Sephardex50分子筛层析，用上述磷酸缓冲液洗脱；Dot ELISA检测LF蛋白洗脱峰，一抗为鼠抗his单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG；(7)鉴定正确后转入发酵罐生长。
LF本身有杀菌抗病毒的作用，在胃中经胃蛋白酶降解后的产物Lfcin的作用更强，它作用机理独特，不同于传统的抗生素，LF通过竞争性夺取细菌繁殖和生长所必需的铁离子而达到抑菌的目的，Lfcin它可以在细菌细胞壁上打孔或溶解细胞壁，引起细胞跨膜电位丧失，细胞内容物外泄而杀死细菌，它不干扰细菌DNA的复制，所以细菌对它不易产生抗药性。众所周知，腹泻是引起仔猪死亡的主要原因，每年给养猪生产造成巨大的损失。仔猪断乳时期是腹泻的高发期，原因之一就是断乳后，仔猪缺少了乳汁中的抗菌成分LF保护而引起肠道PH值和微生态平衡的变化导致腹泻。本发明以pMETα-B或pMET-B为载体，用甲醇酵母表达系统生产和天然LF性质相近的乳铁蛋白。酵母表达系统已经成为高效表达外源蛋白的系统，它即具有原核系统的简单，又具有真核系统的转录后调控能力如糖基化等，即可以在实验室操作，也可以工业化生产，分泌到培养基中的自身蛋白很少，产品纯度高，活性好。利用发酵罐进行工业化生产后，可以大量进行生产，克服了以往从乳中提取LF的复杂和高成本问题。将酵母表达的乳铁蛋白作饲料添加剂，在补充饲料蛋白的同时起到杀菌抗病毒的作用，可有效地防治断乳仔猪的腹泻，以生产出无抗生素残留的高品质畜产品。
具体实施例方式
下面以猪乳铁蛋白为例介绍具体操作方法(1)摘取杜长大泌乳猪乳腺组织50-100毫克，置于事先200℃烘烤并冷却到室温的研钵中，加入1/3研钵积液氮，研磨成粉末并将其转入1.5mlEppendorf管，加入1ml Trizol液，充分混匀，冰上静置5分钟，再加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡混匀后于4℃12000rpm离心30秒，取上层水相于一新的eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后-20℃静置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用1ml75％乙醇洗涤后室温干燥，干燥后将沉淀溶于20-100μL无酶水，得到总RNA提取液，将获得的总RNA提取液用适当的引物，在M-MLV反转录酶作用下进行反转录(RT)，所得产物即为cDNA；(2)设计合成上下游引物上游引物5′TCCCCGCGGGCCCCTAAGAAAGGGGTTCGA-3′，5′-GGACTAGTTGCCTCATCATGAAGGCACAGGC-3′。
PCR反应体系如下灭菌双蒸水 36μL 94℃ 2钟 上下游引物各1μL 72℃ 10分钟cDNA2μL
Taq酶 1μLPCR产物全部上样1.0％糖凝胶电泳，紫外灯下割回2.1kb片段，置于1.5mL离心管，加入600μL 6M NaI，37℃水浴使胶融化完全，加入9μL绑定液，混匀，冰浴15分钟，12000rpm离心5秒，弃上清，450μL 75％冰乙醇洗涤3次，弃上清，至37℃烘箱烘干残余液体，沉淀溶于50μL 0.1×TE，512000rpm离心约1分钟，转上清于一新管，-20℃保存；(3)割胶回收的产物和质粒pGEM-T以4∶1比例加入200μL小离心管用T4DNA连接酶1μL，5Xligase缓冲液1.5μL，15℃连接过夜，以上连接产物5μL转化200μL CaCl2法制备的DH5α感受态细胞，加入37℃预热的LB液体培养基1mL后置37℃摇床，180rpm振荡1小时，同时制备筛选培养基，Amp(+)LB固体培养基表面加40μL 20mg/ml的X-gal和4μL 200mg/ml的IPTG用无菌玻棒涂布均匀，置37℃培养箱使之吸收，上述菌液4000rpm离心5分钟，弃去1ml上清，用移液器轻轻吹打混匀后涂布筛选培养基置37℃培养箱培养12小时以上，直到出现明显而又未相互重叠的单菌落，挑白色单菌落于3mL加入5μL Amp的液体LB培养基，抽提质粒，用SacII和SpeI酶切鉴定重组质粒，筛选阳性出克隆接种于3ml LBA液体培养基37℃振荡培养过夜，测序正确后碱法小量抽提质粒，再用SacII和SpeI酶切后连入用同两种内切酶双切的转移载体pMETα-B或pMET-B得到重组转移载体pMETα-B-LF.或pMET-B-LF(4)线性化pMETα-B-LF或pMET-B-LF重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂重组pMETα-B-LF或pMET-B-LF表达载体75.0μ1，浓度1.0μg/μL；FseI 3～5μL；缓冲液20.0μL，轻轻混匀，37℃下过夜；在此期间根据Invitrogen Pichia Expression Kit进行酵母菌PMAD11或PMAD16感受态的制备，取出100μL与1～3μg上述线性化的重组表达质粒混合，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，于Bio Rad Gene Pulser电转仪750V，25μF，∞Ω条件下电转化后，立即加入1mlYPAD28～30℃静止培养1小时，1500g室温离心3分钟，小心倒净上清，沉淀重悬于100μL的1×YNB，取50μL菌液涂布于MD选择平板上，于28～30℃条件孵育3～4天，观察转化子的生长。
(5)接单菌落于10～50mlBMDY液体培养基中，28～30℃培养16-18个小时，培养至OD600＝2.0～10，离心收集菌体，用5mlBMMY培养基重悬，在28～30℃，255rpm进行培养4天，在诱导过程中，每24小时加1次甲醇使其终浓度0.5％，在0，24，36，72，96小时等时间点取500μL发酵液，离心菌体，用10％SDS-PAGE分析产物。
(6)表达上清过滤除去菌体残渣，于4℃用终浓度70％的硫酸铵沉淀，10000rpm离心15分钟收集沉淀，用浓度为10mmol/L、PH7.4的磷酸缓冲液溶解，用10mmol/L的PBS透析24小时，期间换透析液3次。上Sephardex50分子筛层析，用同种磷酸缓冲液洗脱。Dot ELISA检测LF蛋白洗脱峰，一抗为鼠抗6×His单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG。将收集到的LF洗脱液经冷冻干燥即为纯LF重组表达产物。
(7)鉴定正确后转入发酵罐生长。
重组猪乳铁蛋白，具有天然LF的生物活性，通过酵母表达系统可以大量进行表达，纯化产物可以开发为饲料添加剂。此工艺生产过程简单，产品纯度高.利用甲醇酵母表达系统表达猪乳铁蛋白全长基因目前尚无相关报导，本发明尚属首创。
权利要求
1.一种用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，其特征在于，分为以下步骤1)LF基因的扩增取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到乳铁蛋白或乳铁蛋白肽的cDNA，根据乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆；2)重组酵母表达载体的构建与鉴定将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化，将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的转移载体，得到含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因的重组转移载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含Amp的LB平板上，培养过夜随即挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切及PCR鉴定；3)重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16线性化重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂75.0μl重组表达载体，终浓度达1.0μg/μL；3～5μL线性化酶，20.0μL缓冲液；轻轻混匀，37℃下放置12～16小时；在此期间根据Invitrogen Pichia Expression Kit进行酵母菌PMAD11或PMAD16感受态的制备，取出100μL与1～3μg上述线性化的重组表达质粒混合液，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，于Bio Rad Gene Pulser电转仪在750V，25μF，∞Ω条件下电转化后，立即加入1mlYPAD在28～30℃静止培养1小时，1500g室温离心3分钟，小心倒净上清，沉淀重悬于100μL的1XYNB，取50μL菌液涂布于MD选择平板上，于28～30℃条件孵育3～4天，观察转化子的生长；4)Ade+Muts表型转化子的筛选检测将转化菌落分别对应地点在MM和MD选择平板上，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的菌株；接种单菌落于5mlYPD液体培养基中，28～30℃培养16～20小时后离心，收集菌体，用玻璃珠法提取酵母基因组，并以提取的酵母基因组DNA作模板，用酵母载体上通用的引物进行PCR反应，反应条件如下94℃预变性2分钟，94℃50s，55℃50s，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；两个引物分别为α-Factor5-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3和3′AOXIGAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3′；5)Ade+Muts菌株的诱导表达接单菌落于10～50mlBMDY液体培养基中，28～30℃培养16-18个小时，培养至OD600＝2.0～10，离心收集菌体，用5mlBMMY培养基重悬，在28～30℃，255rpm进行培养4天，在诱导过程中，每24小时加1次甲醇，终浓度为0.5％，在0，24，36，72，96小时等时间点取500μL发酵液，离心菌体，用10％SDS-PAGE分析产物；6)目的蛋白的纯化与鉴定表达上清过滤除去菌体残渣，于4℃用终浓度70％的硫酸铵沉淀，10000rpm离心1 5分钟收集沉淀，用浓度为10mmol/L、PH7.4的磷酸缓冲液溶解，用10mmol/L的PBS透析24小时，期间换透析液3次；上Sephardex50分子筛层析，用上述磷酸缓冲液洗脱；Dot ELISA检测LF蛋白洗脱峰，一抗为鼠抗his单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG；7)鉴定正确后转入发酵罐生长。
全文摘要
本发明涉及一种用毕赤甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，由LF基因的扩增、重组酵母表达载体的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16、Ade+Muts表型转化子的筛选检测、Ade+Mut
文档编号C12N15/81GK1584035SQ200410024630
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月22日 优先权日2004年5月22日
发明者汪以真, 许梓荣, 黄海青, 胡迎利, 刘光富 申请人:浙江大学