一种重组毕赤酵母的培养基及其培养方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物培养技术领域，尤其涉及一种重组毕赤酵母的培养基及其培养方法与应用。
【背景技术】
[0002]巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种单细胞低等真核生物，是近些年来研究热门的一种真核表达系统，具有繁殖快、易培养、基因操作技术成熟、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒物质等特性。现报道的巴斯德毕赤酵母培养基有BMGY、BMMY及BSM。其中BMGY、BMMY培养基用于实验室研究较多，且成分复杂，配置繁琐；另一方面需使用YNB、酵母浸粉、蛋白胨等有机氮源，价格昂贵，不适合工业化生产。BSM培养基为无机盐培养基，其组分简单，配置方便，但易产生沉淀物质，菌体对其敏感，生长速度缓慢，短时间内难到达生产用菌浓度，生产周期长，设备、能源、人力投入大。
[0003]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0004]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母的培养基及其培养方法与应用，旨在解决现有毕赤酵母培养基要么成分复杂，配置繁琐，价格昂贵，要么易产生沉淀物质的问题。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种重组毕赤酵母的培养基，其中，包括:葡萄糖30-40g/L，玉米浆15-20g/L，酵母提取物l_5g/L，硫酸铵5-15g/L，磷酸二氢钾6-12g/L，磷酸氢二钾2_3g/L。
[0006]所述的重组毕赤酵母的培养基，其中，包括:葡萄糖40g/L，玉米浆20g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，磷酸氢二钾3g/L。
[0007]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，包括步骤:
A、菌种的复壮:将甘油管保存的菌种用接种环划线于含有100-300ug/mL博莱霉素的YB)琼脂平板上，28-30°C条件下静止培养48-72h，待有明显单菌落长出，备用；
B、种子培养:挑取2-3个步骤A中得到的单菌落接种到YPD液体培养基中，180-220rpm条件下培养20-24h，确保菌液OD介于2-6范围内；
C、发酵罐高密度发酵培养:将步骤B中培养后得到的菌液按照体积百分比为5-10%接种量接种到发酵罐中的重组毕赤酵母培养基进行培养发酵；培养至重组毕赤酵母培养基的残糖含量在0.5%以下时，用预先准备好的营养液进行补糖；所述营养液在10-14h内补完，补糖过程中发酵液残糖含量控制在0.1%以下；培养发酵过程中用碱液将pH维持在5-6范围内，直到发酵结束。
[0008]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，所述步骤B中，所述YPD液体培养基的成分包括:葡萄糖15-20 g/L，蛋白胨20-25 g/L，酵母浸粉5_10 g/L。
[0009]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，所述步骤B中，所述YPD液体培养基的成分包括:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/Lo
[0010]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，所述步骤C中，所述营养液为葡萄糖溶液。
[0011]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，按质量百分比计，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量的3.5-4.5%。
[0012]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，所述步骤C中，所述碱液为氨水。
[0013]所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其中，所述步骤C中，培养发酵的温度为28-30°C，发酵罐罐压为0.03-0.05Mpa，通风比为1:0.8_1，搅拌的转速为180_250rpm。
[0014]所述的重组毕赤酵母的培养基的应用，其中，将所述重组毕赤酵母的培养基用于培养重组毕赤酵母GS115_ple与重组毕赤酵母X33_ple。
[0015]有益效果:本发明所述重组毕赤酵母的培养基成分简单，用的是廉价的葡萄糖、玉米浆、部分无机盐及少量酵母提取物，且配置方便，适合工业化生产。另外，采用本发明重组毕赤酵母的培养基可产生相同菌体浓度，培养基综合成本更低，工艺简单，适用性强，具备工业化生产潜力，为后续的目的蛋白表达奠定基础。
【附图说明】
[0016]图1为重组毕赤酵母GS115_ple菌株的生长动力曲线图。
[0017]图2为重组毕赤酵母GS115_ple菌株的代谢动力曲线图。
[0018]图3为重组毕赤酵母X33_ple菌株的生长动力曲线图。
[0019]图4为重组毕赤酵母X33_ple菌株的代谢动力曲线图。
【具体实施方式】
[0020]本发明提供一种重组毕赤酵母的培养基及其培养方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021]本发明公开一种重组毕赤酵母的培养基，其包括:葡萄糖30_40g/L，玉米浆15-20g/L，酵母提取物l_5g/L，硫酸铵5-15g/L，磷酸二氢钾6_12g/L，磷酸氢二钾2_3g/L。
[0022]优选地，所述重组毕赤酵母的培养基包括:葡萄糖40g/L，玉米浆20g/L，酵母提取物3g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾6g/L，磷酸氢二钾3g/L。本发明所述重组毕赤酵母的培养基成分简单，用的是廉价的葡萄糖、玉米浆、部分无机盐及少量酵母提取物，且配置方便，适合工业化生产。
[0023]本发明上述重组毕赤酵母的培养基的制备方法，其包括步骤:根据BMGY培养基组分，将廉价的葡萄糖、玉米浆和硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾进行替换BMGY培养基中的成分，然后设计正交表格进行试验，筛选得到所述重组毕赤酵母的培养基。本发明的主要改进在于，基于毕赤酵母的生理特点及代谢规律，通过调整培养基的配方碳氮比(C:N)平衡，筛选得到最优配方的重组毕赤酵母的培养基，筛选得到的所述重组毕赤酵母的培养基利于菌体的高密度繁殖和生长。
[0024]具体地，BMGY培养基的配置步骤为:酵母提取物10g，蛋白胨20g，定容至700mL，121°C高压蒸汽灭菌20min后，添加灭菌的10%甘油lOOmL，13.4%无氨基酸酵母氮源(YNB)100 mL，0.02% 生物素 2 mL，Imol.L 1 磷酸缓冲液 pH6.0 100 mL。
[0025]与现有BMGY培养基相比，本发明选取廉价的葡萄糖、玉米浆和硫酸铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾进行替换上述BMGY培养基中的成分，然后设计正交表格进行试验，筛选最优组合配方，得到所述重组毕赤酵母的培养基。本发明所述重组毕赤酵母的培养基成分简单，用的是廉价的葡萄糖、玉米浆、部分无机盐及少量酵母提取物，且配置方便，适合工业化生产。另外，采用本发明重组毕赤酵母的培养基可产生相同的菌体浓度，且培养基综合成本更低，工艺简单，适用性强，具备工业化生产潜力，为后续的目的蛋白表达奠定基础。
[0026]基于上述培养基，本发明还提供一种如上任一所述的重组毕赤酵母的培养基的培养方法，其包括步骤:
A、菌种的复壮:将甘油管保存的菌种用接种环划线于含有100-300 ug/mL博莱霉素的YB)琼脂平板上，28-30°C条件下静止培养48-72h，待有明显单菌落长出，备用；
本发明的另一主要改进之处在于，在接种培养前先对菌种进行复壮及在含有博莱霉素的YPD琼脂平板上进行抗性压力筛选，从而利于保证所得到的菌种为目的纯培养物。
[0027]所述步骤A具体为，采用对菌种进行复壮，目的在于提高菌体在发酵罐培养过程中的细胞代谢能力。采用含有100-300 ug/mL博莱霉素的YH)琼脂平板进行活化及抗性压力筛选，有利于保证所得到的菌为目的重组毕赤酵母菌。
[0028]B、种子培养:挑取2-3个步骤A中得到的单菌落接种到YPD液体培养基中，180-220rpm条件下培养20_24h，确保菌液OD介于2_6范围内；
所述步骤B具体为，从YPD琼脂平板上挑取2-3个菌落形态较大的单菌落接种到YPD液体培养基中，180-220rpm条件下培养20_24h，确保菌液OD介于2_6范围内；其中，所述YPD液体培养基为500mL三角瓶装液体培养基lOOmL。其中，所述YPD液体培养基的成分包括:葡萄糖15-20 g/L，蛋白胨20-25 g/L，酵母浸粉5_10 g/L。优选地，所述YTO液体培养基的成分包括:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L ο
[0029]C、发酵罐高密度发酵培养:将步骤B中培养后得到的菌液按照体积百分比为5-10%接种量接种到发酵罐中的重组毕赤酵母培养基进行培养发酵；培养至重组毕赤酵母培养基的残糖含量在0.5%以下时，用预先准备好的营养液进行补糖；所述营养液在10-14h内补完，补糖过程中发酵液残糖含量控制在0.1%以下；培养发酵过程中用碱液将pH维持在5-6范围内，直到发酵结束。
[0030]所述步骤C具体为，将步骤B中培养后得到的菌液按照体积百分比为5-10%接种量接种到发酵罐中的重组毕赤酵母培养基进行培养发酵；其中，在发酵罐装量为50-70%，培养发酵的温度为28-30 °C，发酵罐罐压为0.03-0.05Mpa，通风比为1:0.8_1，搅拌的转速为180-250rpm的条件下进行培养发酵(即发酵液溶氧数值维持在30%以上)。然后在培养发酵约12-14h，发酵液菌体湿重达到75g/L左右，重组毕赤酵母培养基的残糖含量在0.5%以下时，开始用预先准备好的营养液进行补糖。优选地，所述营养液为葡萄糖溶液。按质量百分比计，所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量的3.5-4.5%。其中，所述补糖以间歇或连续流加方式进行，且所述营养液要求在10-14h内补完，补糖过程中发酵液残糖含量控制在0.1%以下。当补糖开始后，通风量逐步提升，最高至1: 1.2，搅拌转速维持在250rpm不变。当发酵液PH值低于5.0时需要补碱液(如氨水)或纯碱将pH调节到5-6范围内，直到发酵约22-26h结束。
[0031]本发明的又一主要改进在于，上述步骤C中，采用间歇或连续流加方式进行补糖，可有效克服葡萄糖对菌体代谢和繁殖的抑制作用，避免代谢副产物乙醇、乙酸等有害物质产生及积累，更有利于菌体的高密度生长繁殖。另外，发酵过程中发酵液PH值控制在菌体生长繁殖的最适合范围，溶解氧维持30%以上，为菌体的生长繁殖提供一个良好的环境。此外，整个发酵培养过程中采用流加氨水调整发酵液PH值，流加氨水可以代替碱液调节pH值的同时，还可以补充菌体需要的