一株内生枯草芽孢杆菌YC01及其在防治油茶炭疽病中的应用的制作方法

本发明属于植物病害生物修复领域，具体地说，涉及一株内生枯草芽孢杆菌yc01及其蛋白与脂肽提取物在在防治油茶炭疽病中的应用。
背景技术：
：油茶是我国特有的木本油料作物，主要分布于我国南方地区，与油棕、油橄榄和油椰子并称为世界四大木本食用油树种，世界上约90％的油茶籽油产量来自于中国。油茶产业是湖南省农林生产的特色产业，湖南省是国内最大的油茶产地和最大的茶油消费区。根据《湖南省油茶产业发展规划(2011-2020年)》，到2020年，湖南将建成2200万亩高产油茶园，年产值400亿元以上，成为湖南省农业产业的支撑产业。油茶炭疽病是油茶最重要的病害之一，其病原菌主要是胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)，广泛分布于我国南方各省，可引起油茶树严重的落蕾和落果，落果率通常在20％左右，严重时高达50％。当前对油茶炭疽病的防治主要通过种植抗性品种和化学防治来控制，但长期的化学防治导致有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如造成残毒、污染环境，对人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于油茶产业的可持续发展。由于生物防治与环境的良好兼容性，给植物病虫害防治提供了新的思路与选择。目前应用较多的生防细菌主要包括芽孢杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonas)、土壤放射杆菌(agrobacteriumradiobacter)等。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，是芽孢杆菌科芽孢杆菌属最具代表性的菌种，这种内生芽孢的杆状细菌也是研究革兰氏阳性细菌细胞生物学的模式菌株。枯草芽孢杆菌可以作为作物病害生物防治的良好资源，具有广泛的应用前景。技术实现要素：本发明提供了一株内生枯草芽孢杆菌菌株，可以作为油茶生产上油茶炭疽病的良好生物防治菌剂，并且为油茶炭疽病的田间生物防治提供依据。本发明提供了一株从油茶健叶分离得到的内生生防菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，编号yc01，于2017年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14186。本发明菌株对油茶炭疽病菌具有较好的拮抗效果，根据菌株形态学特征、生理生化特征、16srdna序列同源性分析，将菌株yc01鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。本发明所述枯草芽孢杆菌yc01的菌剂可采用lb培养基，按常规方法进行培养。本发明还提供含有所述枯草芽孢杆菌yc01的菌剂。所述菌剂的制备方法为：lb培养基接种菌种yc01，160-200r/min，25-28℃条件下发酵培养4-8天。根据不同的应用方面制备成液体制剂或固体制剂。具体地，一种含有所述枯草芽孢杆菌yc01的液体菌剂的制备方法包括：用250ml三角瓶装100ml液体lb培养基，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，挑取yc01菌体接种入发酵三角瓶中，振荡培养，28℃，160r/min条件下培养24h马上转入发酵罐发酵，28℃，160r/min条件下培养96h中止发酵。发酵液采用塑料瓶或者塑料袋进行分装。本发明还包括上述内生枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yc01，其代谢产物、蛋白粗提物、脂肽粗提物以及含其菌剂在防治油茶炭疽病中的应用。本发明所述内生枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yc01的代谢产物、蛋白粗提物、脂肽粗提物均可按本领域常规方法制备。本发明菌株可应用于生产上油茶炭疽病的生物防治，以及与化学农药协同防治油茶炭疽病；防治效果显著。附图说明图1为本发明菌株yc01的菌落形态照片；图2表示本发明菌株yc01对油茶炭疽病菌的平板拮抗效果；图3为本发明菌株yc01菌株的系统发育树；图4表示本发明菌株yc01发酵液中蛋白(db)提取物对油茶炭疽病的防治效果；图5表示本发明菌株yc01发酵液中脂肽(zt)提取物对油茶炭疽病的防治效果。本发明菌株yc01的16srdna序列见seqno.3。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1拮抗菌株的分离与鉴定采用平板划线法从油茶健叶分离得到一株对油茶炭疽病菌有较好拮抗作用的内生生防菌yc01，yc01菌落形态如图1所示。1、培养基：lb培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g(固体培养基加琼脂15g)，1000ml去离子水，ph7.0，高压蒸汽灭菌121℃，30min。2、内生拮抗菌分离纯化选取油茶健叶，用水冲洗干净叶片表面，选取适量的健叶组织，称量后剪成4mm2的组织块，在75％乙醇中浸泡60s，然后在0.1％升汞溶液中浸泡40s，再放入75％乙醇浸泡30s，取出健叶组织块用无菌水冲洗4次，彻底去除消毒液。在无菌研钵内加入10ml无菌水和少许灭菌的石英砂研磨成匀浆，加盖静置30min，将匀浆用无菌水进行10倍系列梯度稀释，用移液枪分别吸取0.1ml稀释液至灭菌的lb平板，涂抹均匀后放入培养箱培养，36-48h后根据菌落形态、颜色和大小挑取不同菌落，并分别在lb平板上进行纯化保存。平板对峙法初筛：将直径为6mm的油茶炭疽病菌放于pda平板中央，然后用接菌环蘸取待测细菌的悬浮液等距离(距平板中央3cm)点接2-3种内生细菌，培养箱中28℃条件下培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，重复3次，选取抑菌带宽度较大的菌落进行复筛。发酵法复筛：将初筛的内生拮抗菌在lb平板上活化后，用接菌环移取一环放入50ml液体lb培养基中，28℃、160rpm条件下振荡培养72h。细菌培养液经离心去除菌体后用0.22μm细菌过滤器过滤，将滤液与约50℃的pda培养基按1:19比例混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为6mm的油茶炭疽病菌菌饼(或水稻纹枯病)，用无菌水作为空白对照，4d后用十字交叉法测量病菌菌落直径，选出抑菌效果最好的菌株，保存备用。病原菌生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100％发酵法复筛结果表明，yc01发酵液对油茶炭疽病菌的抑制效果可达85％以上(图2)。3、菌株yc01的鉴定yc01形态特征：yc01菌株菌落在lb培养基上表面粗糙不透明，污白色或微黄色(图1)。扫描电镜下菌体呈短杆状。yc01菌株生理生化特性：革兰氏染色阳性，接触酶、氧化酶、vp试验、葡萄糖利用、甘露醇水解、淀粉水解、明胶液化试验阳性。分子鉴定：采用试剂盒提取降解菌dna，所用扩增引物由上海生工合成：上游引物为5’-cagagtttgatcctggct-3’，下游引物为5’-aggaggtgatccagccgca-3’。扩增反应体系为：10×buffer(mg2+)2.5μl，dntps1μl，引物各0.5μl，菌体dna0.5μl，taqdna聚合酶0.2μl，加去离子水至25μl。pcr反应条件：94℃4min，94℃45s，55℃40s，72℃60s；30个循环；最后于72℃修复延伸10min，4℃条件下终止反应。pcr产物采用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行目的片段回收，回收产物测序工作由上海生工公司完成。测序结果进入genbank数据库进行比对。将yc01菌株的16srdna序列(即seqno.3)共1509bp登陆到genbank进行比对并构建系统发育树(图3)，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。将该菌于2017年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14186。实施例2yc01菌株对油茶炭疽病的防治效果将实施例1分离的yc01菌株转入新鲜的lb平板上进行活化，随后挑取菌落转入液体lb培养基振荡培养4d，将发酵液进行离心去除菌体，上清液备用。采集叶龄一致的健康油茶新生叶片，用75％酒精对叶片进行表面消毒后用无菌水将叶片表面残留酒精冲洗干净，置于培养皿中，油茶叶片叶柄用脱脂棉包裹，并用无菌水保湿。用灭菌的接种针刺伤叶片的上表面但不刺穿，每个叶片刺伤一处。将油茶炭疽病菌转入新鲜的pda平板进行活化，28℃条件下连续培养4-5d，在菌落边缘用打孔器打取直径6mm的菌丝块，将菌丝块接种于油茶叶片刺伤处，每个处理10片叶片。共设置ck组(油茶叶片刺伤并接种炭疽病菌菌丝块)、control组(健康油茶叶片且不接种炭疽病菌菌丝块)、处理组(油茶叶片刺伤后，以yc01发酵液上清液均匀涂抹叶片，随后接种炭疽病菌菌丝块于刺伤处)。接种5d后逐天观察油茶叶片发病情况并记录统计。结果见表1。表1菌株yc01发酵液对油茶炭疽病的防治效果处理叶数发病叶数发病率防治效果ck10990％--control1000--yc01处理10220％77.8％结果表明，yc01发酵液对油茶炭疽病的防治效果达到77.8％。实施例3菌株yc01蛋白粗提物对油茶炭疽病的防治效果将实施例1分离的yc01菌株转入新鲜的lb平板上进行活化，随后挑取菌落转入液体lb培养基振荡培养4d，将发酵液进行离心去除菌体，上清液备用。上清液采用饱和硫酸铵法(相对饱和度50％)沉淀蛋白成分。蛋白处理办法同实施例2，共设置ck组(油茶叶片刺伤并接种炭疽病菌菌丝块)、control组(健康油茶叶片且不接种炭疽病菌菌丝块)、处理组(油茶叶片刺伤后，以yc01蛋白提取物稀释液均匀涂抹叶片，随后接种炭疽病菌菌丝块于刺伤处)。接种5d后逐天观察油茶叶片发病情况并记录统计。结果见表2。表2菌株yc01蛋白提取物对油茶炭疽病的防治效果处理叶数发病叶数发病率防治效果ck1010100％--control1000--蛋白提取物处理10110％90％结果表明，yc01发酵液蛋白提取物对油茶炭疽病防治效果可达90％(图4)。实施例4菌株yc01脂肽粗提物对油茶炭疽病的防治效果将实施例1分离的yc01菌株转入新鲜的lb平板上进行活化，随后挑取菌落转入液体lb培养基振荡培养4d，将发酵液进行离心去除菌体，上清液备用。上清液采用盐酸沉降的方法分离其拮抗活性成分，用盐酸将上清液调节ph至2.0并沉淀过夜，然后10000r/min条件下离心20min，得到沉淀，沉淀用甲醇抽提2次，每次抽提2h，合并甲醇抽提物。甲醇抽提物减压浓缩后过0.22μm滤膜，即为脂肽类化合物粗提物。脂肽处理办法同实施例2，共设置ck组(油茶叶片刺伤并接种炭疽病菌菌丝块)、control组(健康油茶叶片且不接种炭疽病菌菌丝块)、处理组(油茶叶片刺伤后，以yc01脂肽提取物稀释液均匀涂抹叶片，随后接种炭疽病菌菌丝块于刺伤处)。接种5d后逐天观察油茶叶片发病情况并记录统计。结果见表3。表3菌株yc01脂肽提取物对油茶炭疽病的防治效果处理叶数发病叶数发病率防治效果ck10990％--control1000--脂肽提取物处理10110％88.9％结果表明，yc01发酵液中脂肽提取物对油茶炭疽病防治效果可达88.9％(图5).实施例5菌株yc01微生态菌剂的制备活化实施例1分离的菌株yc01，接种至液体lb培养基，160r/min，28℃恒温箱培养96h。yc01液体制剂的制备：用250ml三角瓶装100ml液体lb培养基，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，挑取yc01菌体接种入发酵三角瓶中，振荡培养，28℃，160r/min条件下培养24h马上转入发酵罐发酵，28℃，160r/min条件下培养96h中止发酵。发酵液采用塑料瓶或者塑料袋进行分装。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。sequencelisting<110>湖南农业大学<120>一株内生枯草芽孢杆菌yc01及其在防治油茶炭疽病中的应用<130>khp171113966.5<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1cagagtttgatcctggct18<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1aggaggtgatccagccgca19<210>3<211>1509<212>dna<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）yc01<400>1ggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctcctaa60aaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtac120aaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagctt180cacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaa240cctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcata300aggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcacct360tagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggactta420acccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccg480aaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgc540gttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttga600gtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcacta660aggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtat720ctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcg780ccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattcca840ctctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggg900gctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggaca960acgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggt1020taggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagc1080tttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccatt1140gcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgt1200ggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcacca1260actagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctg1320aaccatgcggttcagacaaccatctggtattagccccggtttcccggagttatcccagtc1380ttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagct1440cccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccag1500gatcaaact1509当前第1页12