专利名称：一种防病促生长植物内生枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对农作物具有防病促生长作用的植物内生细菌枯草芽孢杆菌Jaas ed3及其在农业上的应用，属于农业集约化生产技术领域。
背景技术：
植物内生细菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，它们生活在健康植物的各种组织和器官内部而不引起植物病变，是与寄主植物在长期的共同进化过程中建立起互惠共存、相互制约的和谐联合关系的一类微生物。内生细菌对宿主植物具有广泛的有益生物学作用，如促生、防病、抗逆等。内生细菌可以通过生物固氮和产生促进植物生长物质如植物生长素、赤霉素以及细胞分裂素等，直接促进植物生长；可以通过诱导寄主植物产生植物激素，通过增强植物吸收N、P等营养元素以及其他矿物质的吸收间接促进植物生长；还可以通过改变寄主植物对霜冻等有害环境条件及有害病原生物的敏感性等促进植物的生长。植物内生细菌与从土壤中分离到的拮抗细菌相比，具有不易受环境条件的影响，在植物体内具有稳定的生存空间，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递等优势，筛选有益的内生细菌有可能成为生物防治中最具潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。利用内生细菌对土传维管束病害进行生物防治的优势更为突出，由于土传维管束病害的病原菌侵染植株后，就在寄主植物维管束中生长、繁殖、为害，造成化学药剂防治困难，效果不理想又污染环境，而内生细菌可以通过在植物体内定殖，与病原菌争夺生存空间，产生拮抗物质直接对病原菌作用等达到防病控病的目的。化学肥料和化学农药的污染已经成为影响人类健康和造成环境恶化的重要原因之一，因而生物肥料和生物农药越来越引起人们的重视。内生细菌作为生物防治的重要手段，能够发挥其生态学、经济学和社会学效应，符合保护环境、无污染和人类健康安全的观念。植物内生细菌能够促进植物生长、防治病虫害发生，对于替代或减少化学肥料和化学农药的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，维护农田生态平衡，实现农业的可持续发展将起到重要作用，因此，研究和利用植物内生细菌具有广阔而诱人的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够对多种病原菌具有拮抗作用、对农作物具有防病促生长作用且能定殖在农作物体内的枯草芽孢杆菌Jaas ed3。利用该菌株可开发出新型的生防菌剂，满足无公害农产品的生产要求。本发明所提供的植物内生细菌是2004年从中国江苏省南京市的茄子组织中分离获得，2012年对该菌株进行了菌种鉴定，结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为Jaas ed3，并于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 6576。该菌株具有下述性质I、菌落形态特征
该菌株在NA培养基上生长良好，菌落不透明，乳白色，扁平微隆起，表面有褶皱，边缘不规则。2、菌体形态特征菌体细胞杆状，产生芽孢。3、主要生理生化特征革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖产酸；利用葡萄糖不产气P反应阳性；淀粉水解阳性；明胶液化阳性；分解酪素阳性。4、遗传学特征性利用Eubac27F和Eubacl492R为引物进行PCR扩增出16S rRNA基因的部分序列1511bp,并向GenBank提交,登录号为JX849659。将该序列在www. ncbi. nlm. nih. gov网站上用BLAST工具与GenBank中已登录的部分菌株的16S rRNA基因序列进行相似性比较，结果表明与枯草芽孢杆菌的相似性达99%。因此，通过对该菌株进行形态特征、生理生化特征和遗传学特征性进行鉴定，本发明所述的植物内生细菌Jaas ed3属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过常规的微生物发酵方法可以培养本发明所述的植物内生细菌，并制得以本发明所述的植物内生细菌为有效成分的生防菌剂。该菌的最适PH为6. 0-8. 0，最适培养温度为25-30°C，可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。在制造以本发明所述的植物内生细菌为生防菌剂时，可同样使用该技术领域中已知生防菌剂通用的培养基，配制成水剂、粉剂等任意的剂型。本发明的所述的植物内生枯草芽孢杆菌及制得的以其为有效成分的生防菌剂与现有技术相比具有如下优点。I、可以在植株体内定殖传导本发明所述的植物内生枯草芽孢杆菌可以在西瓜、茄子等多种农作物体内定殖，并且可以在植株体内传导。2、可以促进植株生长用本发明所述的植物内生枯草芽孢杆菌菌液灌根西瓜苗，可显著提高植株的株高和鲜重。3、对西瓜枯萎病具有突出的防治效果用本发明所述的植物内生枯草芽孢杆菌菌液对植株进行灌根对西瓜枯萎病有突出的防治效果。4、对多种作物病原真菌具有拮抗活性本发明所述的植物内生枯草芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、莴苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。
具体实施例方式下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例I液体制剂
将植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3菌株接种到试管斜面上，培养基为NA，25°Cfl温培养2-4天，获得试管种。将试管种接种到NB培养基中，28°C恒温振荡培养过夜后，按O. I %的接种量转接于NB培养基中，28°C恒温振荡培养14小时后的培养液即可为制剂。配方一、普通细菌NA培养基(重量％ )牛肉浸膏O. 3 %，酵母膏O. 1%，蛋白胨O. 5%，葡萄糖1.0%，琼脂1.5-2. O %，pH6. 8-7. O0配方二、普通细菌NB培养基(重量％ )牛肉浸膏0.3%，酵母膏O. 1%，蛋白胨O. 5%，葡萄糖I. 0%，ρΗ6. 8-7. O。实施例2对西瓜苗的促生长作用将催芽的西瓜种子播种于温室盆钵中，待西瓜苗长至2 3片真叶时，将稀释后的植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3菌液浇于西瓜苗根际，20天后测量苗高并称鲜重，试验结果表明该菌株对西瓜苗具有明显的促生长作用，株高比对照增长27.5%，鲜重比对照增长48. 4%。实施例3对西瓜枯萎病的防治作用将催芽的西瓜种子播种于温室里装有病土的盆钵中，待西瓜苗长至2片真叶期时，对西瓜苗根部每隔5天用稀释后的植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3进行灌根处理，连用3次，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，最后一次处理后23天调查枯萎病的病情。本发明所述的内生细菌对西瓜枯萎病的防治效果为63. 2%。在大棚中，待西瓜苗长至3 4片真叶期时，对西瓜苗根部灌浇西瓜枯萎病菌孢子液，第2天再用稀释后的植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3进行灌根处理，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，20天后调查枯萎病的病情。本发明所述的内生细菌对西瓜枯萎病的防治效果为45.8%。实施例4对多种病原真菌的拮抗作用在PDA平板中心处接直径为5mm病原真菌菌饼，25°C，培养1_3天后，在菌落边缘
I.5cm处接活化好的植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3，6_7天后测量抑菌圈。结果表明本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、莴苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。实施例5在西瓜、茄子植株体内定殖将催芽的西瓜或茄子种子播种于温室盆钵中，待西瓜或茄子苗长至2 3片真叶时，将稀释后的经利福平标记后的植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed3菌液浇于西瓜苗或茄子苗的根际。每隔3天取距土表Icm的地上茎组织，用表面消毒-研磨-铺平板技术再分离回收经利福平标记的菌株，以检测内生细菌在植株体内的定殖情况，试验结果表明该菌株在西瓜苗或茄子苗中可以定殖12天以上。
权利要求
1.一种具有防病促生长作用的植物内生细菌Jaas ed3，其特征在于该菌是一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),已于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 6576。
2.根据权利要求I所述的一种植物内生细菌，其特征在于，该菌株在NA培养基上生长良好，菌落不透明，乳白色，扁平微隆起，表面有褶皱，边缘不规则；菌体细胞杆状，产生芽孢；革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖产酸；利用葡萄糖不产气；V.P反应阳性；淀粉水解阳性；明胶液化阳性；分解酪素阳性；用抗利福平与拮抗病原真菌双标记进行 内生测定，从植株体内回收分离的菌株，在含利福平培养基上出现相同的菌落。
3.权利要求I或2所述植物内生细菌在制剂生产中的应用，其中以权利要求I或2所述植物内生细菌为生产菌株来生产制剂。
4.以权利要求I或2所述植物内生细菌为有效成分的制剂在农业上应用。
全文摘要
本发明涉及一种对农作物具有防病促生长作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaased3及其应用，属于农业集约化生产技术领域。本发明采用的菌株Jaas ed3已于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6576。该菌株对西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、莴苣菌核病菌、茄子黄萎病菌等多种病原真菌具有拮抗活性；并且可在较低的菌液浓度下进入西瓜、茄子等植株体内，并能在农作物体内定殖和传导；对农作物具有促进生长、防治病害的作用，尤其对土传维管束病害具有良好的防治效果。将该菌株用于制剂生产成本低廉，操作简单，有利于保护农田生态环境，减少农药残留，适合于我国无公害农产品生产的要求。
文档编号A01P3/00GK102925394SQ201210460840
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者林玲, 王卿, 张昕, 邓晟 申请人:江苏省农业科学院