专利名称：一株短小芽孢杆菌及其在防病促生中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株短小芽孢杆菌，及其在防治烟草真菌、细菌病害以及促生中的应用。
背景技术：
烟草从育苗到收获，往往会遭受多重真菌病害的危害，国内有记载的烟草真菌、细菌病害60余种，其中危害重的近10种，主要包括烟草黑胫病、烟草青枯病、赤星病、炭疽病、 低头黑病及白粉病等。有些病原可在烟草的各个生育期危害，有些病原只在烟草的某个生育期危害某些器官；除此之外，有些烟草病害如烟草白粉病等有一定的区域性，另外一些病害如烟草黑胫病、烟草赤星病和烟草炭疽病几乎没有区域限制，常随着不同年份的气候而发生流行。随着烟草专业化生产的不断发展，对品质产量的要求越来越高，加强研究和防治烟草真菌病害是保证烟草优质、高产的主要措施。近年来，烟草真菌和细菌病害的危害呈上升趋势，造成烟田严重减产。据全国烟草病虫害预测预报及综合防治网统计，2007和2008年16个烤烟主产省真菌、细菌病害发生面积均累计800万亩以上，产量损失3000万千克以上，产值损失3亿元以上，烟草病害的危害已成为制约我国烟草产业发展的一个重要瓶颈。烟草主要真菌和细菌病害的症状及危害如下(1)烟草黑胫病病原菌主要从茎基部侵染并产生黑斑，很快向茎上扩展，病株叶片自上而下依次变黄，纵剖病株茎部，髓部变黑褐色，干缩成碟片状，碟片间可见白色菌丝。病原菌为烟草疫霉菌。目前，烟草黑胫病除东北烟区零星发生外，全国其它烟区均普遍发生，我国烤烟平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。( 烟草青枯病该病在我国俗称为“烟瘟”、 “半边疯”，是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性维管束病害， 发病烟株叶片萎蔫下垂直至枯死。对烟草产量和质量影响极大，是威胁世界烟草生产的毁灭性病害之一，在中国南方烟区普遍发生，目前该病造成的损失已各类侵染性病害第4位， 必须重视该病的防治工作；(3)烟草赤星病又称“火炮斑”，一般从下部叶片开始发生，以后逐渐向上部叶片发展，最初叶片上出现黄褐色斑点，以后变成褐色，病斑产生明显的同心轮纹，质脆，易破，病斑边缘明显，外围有淡黄色晕环，病斑中央有黑色的霉状物；是烤烟生产上主要病害之一，多发生于生长中后期，对烤烟生产影响很大。(4)烟草炭疽病多发生于苗期，发病初期，在叶片上产生暗绿色水浸状斑点，l-2d内可扩展成直径2-5mm的圆斑， 中央为灰白色或黄褐色，稍凹陷，边缘明显，稍隆起呈赤褐色，俗称“水点子”，天气多雨时叶片柔嫩，病斑多呈褐色，有时有轮纹或产生小黑点即病原菌的分子孢子盘。茎上病斑较大， 呈网状纵裂条斑、凹陷。病原为烟草刺盘孢菌。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此烟草病害的生物防治越来越被重视。利用有益微生物防治植物病害，已成为一个十分活跃并开始显示良好应用前景的令页域。i午多论著报道(Cook, K. J. and Baker K. F. The nature and practice of biological control of plant pathogens. 1984，APS press USA)认为生物防治在未来农业中具有重
3要地位。大量的研究表明，无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，生防细菌的作用是非常明显的。其主要优势在于1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；幻细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；幻具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。因此本发明将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗细菌菌株， 并对其防病促生效果进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其抗菌物质防治烟草真菌和细菌病害提供研究基础和实验材料。在植物的根围、叶围及其它微生态区系中，拮抗细菌广泛存在，且由于培养方便、 生长周期短、作为新拮抗菌来源具有很大的开发潜力。烟草真菌病害是危害烟草生产中最严重的病害，每年都造成烟叶产量的严重损失和品质下降，是烟草生产中一个很重要的制约因素。如何有效地防治和减轻烟草真菌病害的危害一直是许多科研工作者的目标。不合理的化学防治不仅提高了防治成本导致烟叶农药残留量增加，且抗药性不断增强，影响烟叶质量；选育抗病品种很难，且抗性容易丧失。因此不断寻找新的烟草真菌、细菌病害防治方法是一项长期的任务。国内对烟草真菌、细菌病害的生物防治已有报道，但多数生防菌株仅针对于某一种病害有良好的防治效果，对多种真菌、细菌病害病原菌均具有生防作用的芽孢杆菌菌株国内鲜有研究和报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株防病促生生防短小芽孢杆菌菌株，其可用于烟草真菌、细菌病害的生物防治，为真菌、细菌病害的防治提供了新的微生物资源。本试验将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗细菌菌株，并对其防病促生效果进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其抗菌物质防治烟草真菌和细菌病害提供研究基础和实验材料。本发明是通过以下技术方案实现的一株短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus,已于2010年08月 23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No. 4117。本发明的菌株菌株具有蛋白酶活性，室内拮抗试验显示该菌株对烟草黑胫 |if (Phytophthora parasitica var. nicotianaer)、 胃胄 δ _ lif (Ralstonia
solanacearum)、赤星病菌(Alternaria alternata(Fries)Keissler)及炭疽病菌 (Colletotrichum micotianae verna)均有较好的抑制作用；其发酵液抑制黑胫病菌和赤星病菌菌丝的生长并致菌丝畸形、膨大。本发明针对烟草主要真菌和细菌病害病原菌烟草黑胫病菌(Wiytophthora parasitica var. nicotianaer)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、赤星病菌 (Alternaria alternata (Fries)Keissler)及炭疽病菌(Colletotrichum micotianae verna)，通过室内平板对峙法和活体温室防效测定，筛选出在温室条件下对具有良好防病作用的拮抗菌株AR03，测定其16srDNA全序列，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，AR03菌株的序列与短小芽孢杆菌16s rDNA部分序列相同，同源性100%，因此鉴定AR03菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。该菌株的培养条件为30°C，普通牛肉汁蛋白胨培养基，PH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、短小芽孢杆菌种；经鉴定，关于该菌株的信息包括能形成芽孢；含菌发酵液对上述三种真菌的抑制作用显著，而除菌发酵液对病原真菌无抑制作用(见图2)。生物学测定表明，AR03菌体及发酵液在牛肉汁平板上能够抑制黑胫病菌、烟草赤星病菌及炭疽病菌及青枯雷尔氏菌的生长；AR03菌体对黑胫病菌菌丝的抑制表现为处理后的菌丝细胞质聚集为球状，与细胞膜脱离，不能正常生长；AR03菌体对赤星病菌菌丝的抑制表现为分隔菌丝严重变形、膨大，顶端生长畸形。另外，AR03菌株尚具有蛋白酶活性(见图9)。防病试验显示，AR03菌株发酵液对烟草黑胫病的防治效果理想，不但能推迟烟草黑胫病的发病时间；在接种后第30d时，AR03 发酵液处理的防效达到68. 4%，高于对照药剂58%甲霜 锰锌处理的防效。对青枯病的防治试验显示，AR03发酵液对烟草青枯病的防效为70. 2%。促生试验结果显示，在自然菌土中，经AR03处理后烟苗的各指标均比对照高， 平均株高、整株鲜重、整株干重和根干重的增长率分别是42. 5 ^^39.0%, 109. 4%和 130. 2%，促生作用明显。由上可见，本发明的短小芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂，能够促进作物生长，尤其是烟草，蔬菜可以是黄瓜、辣椒、茄子、番茄等。本发明通过优化菌株AR03的发酵条件，建立了 AR03最佳发酵条件为0. 9%牛肉膏+1.5%蛋白胨+1%葡萄糖+0. 5% NaCl ；发酵起始pH值为7. 3、300ml的三角瓶装瓶量为 60ml、接种量为8%、温度为31°C、转速为140r/min，发酵时间为36h。利用AR03固体发酵菌剂防治烟草黑胫病的田间试验结果显示，AR03与72%甲霜灵锰锌联合使用的防效和促生作用最佳，单独施用AR03效果次之，均好于单独施用化学药剂。该菌株热稳定性好，抗逆性强，促生效果俱佳，是优质的微生物农药，是优质的微生物农药资源。可以预见，本发明的菌株将有着广阔的应用前景。
本发明的短小芽孢杆菌命名为Bacillus pumilus，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCN0. 4117，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编100101。图1为实施例1中AR03对烟草黑胫病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03，右为空白对照。图2为AR03发酵液对烟草黑胫病菌的拮抗活性。其中，上面两皿为AR03除菌发酵液处理，下面皿为无菌水处理。图3为AR03对黑胫病菌菌丝生长的抑制作用示意图，其中，左为黑胫病菌正常菌丝，右为AR03处理后畸形菌丝。图4为AR03对烟草赤星病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03，右为空白对照。图5为AR03发酵液对烟草赤星病菌的拮抗活性示意图，其中，左为AR03发酵液， 右为无菌水。
图6为AR03对赤星病菌菌丝生长的抑制作用示意图，其中，左为黑胫病菌正常菌丝，右为AR03处理后畸形菌丝。图7为AR03对烟草炭疽病菌的拮抗活性示意图。图8为AR03对青枯雷尔氏菌的拮抗活性示意图。图9为AR03蛋白酶活性示意图。图10为AR03菌株对烟草青枯病盆栽防治效果示意图，其中，右为AR03发酵液灌根处理，右为CK。图11为AR03菌株促生作用示意图，其中，左为AR03处理，右为对照。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 AR03及其发酵液对烟草主要真菌、细菌病害病原菌的拮抗作用接种AR03于NA平板上30°C培养48h，然后采用平板对峙法，即在燕麦平板上接种黑胫病菌、赤星病菌、炭疽病菌菌饼(直径为3mm)，用接种环挑取AR03并以菌饼为中心等距离划线，置于30°C培养5d，对青枯雷尔氏菌的抑制采用平板扩散法；观察AR03对上述各致病菌的抑制情况。从室内平板抑菌效果看，AR03菌体对烟草黑胫病菌、赤星病菌、炭疽病菌及青枯雷尔氏菌均具有很好的抑制作用(见图1、4、7和8)。AR03菌株发酵液的拮抗活性是将活化的AR03接种于NB培养基中30°C振荡培养 4 得到发酵液，分别取其含菌发酵液和去菌体后的上清液按照滤纸条法测定其对黑胫病菌的拮抗活性，具体方法如下分别在无菌滤纸条(7mmX3mm)均勻滴入50μ 1，按照十字交叉方向小心将滤纸条置于培养皿中，然后将黑胫病菌和赤星病菌菌饼等距离接种在滤纸条的空当中，30°C培养5d，观察烟草黑胫病菌的拮抗活性，从结果可以看出，AR03含菌发酵液对烟草黑胫病菌、赤星病菌均有很强的拮抗作用，而除菌上清液无抑制作用(见图2、5)。实施例2 AR03发酵液对烟草黑胫病的盆栽防治效果AR03发酵液对烟草黑胫病和青枯病的盆栽防治效果采用AR03发酵液灌根的方法处理烟苗，具体方法如下将活化的AR03菌株接入NB培养基中，摇床振荡培养4 后，稀释100倍(培养液浓度为l*108cfu/ml)，备用。黑胫病菌菌谷的制备黑胫病菌活化后，接入装有谷子培养基的三角瓶中，恒温08)培养8d，即黑胫病菌长满谷子培养基后从三角瓶中取出，碾碎即得到菌谷。供试烟草品种为小黄金1025，取3-4片叶烟苗，移栽到花盆中，用 AR03培养液灌根，每株50ml，间隔7天连续灌根2次。第一次灌根后5天接种黑胫病菌菌谷，方法是在烟苗的茎基部挖穴，施入2克/株，然后封穴。共处理12株烟苗复，对照药剂为 58%甲霜灵 锰锌可湿性粉剂，600倍稀释，每株灌根50ml，间隔7天连续灌根2次；设空白 CK0调查结果显示(见表1)，第1次调查，即接种后15d，拮抗细菌AR03培养液(IXlO8Cfu/ ml)对烟草黑胫病的的田间防治效果为79.3%，而对照药剂58%甲霜.锰锌WP的防效仅为64. 8%，差异显著；第2次调查，即接种后30d，AR03菌株对烟草黑胫病的防治效果下降为68. 4%，而对照药剂的防效为60. 6 %，差异不显著。表1拮抗细菌AR03培养液防治烟草黑胫病试验*
权利要求
1.一株短小芽孢杆菌，其特征在于该菌株命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus, 已于2010年08月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为 CGMCC No. 4117。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌在防治烟草真菌、细菌病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述烟草真菌、细菌病害包括烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌。
4.权利要求1所述的短小芽孢杆菌在防治蔬菜真菌、细菌病害中的应用。
5.权利要求1所述的短小草芽孢杆菌在促进烟草或蔬菜生长中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述蔬菜包括黄瓜，辣椒，茄子，番茄。
全文摘要
本发明公开了一株短小芽孢杆菌，命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，已于2010年08月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。本发明的短小芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂，能够促进作物生长，尤其是烟草。该菌株热稳定性好，抗逆性强，促生效果俱佳，是优质的微生物农药，是优质的微生物农药资源。可以预见，本发明的菌株将有着广阔的应用前景。
文档编号C12R1/07GK102296036SQ20111014668
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者孔凡玉, 张成省, 王静 申请人:中国农业科学院烟草研究所