检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用的制作方法

检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本方法基于该病原的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的特异保守引物和TaqMan探针建立了一种实时荧光PCR定性检测方法，能够在1.5小时内同时分别对尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种进行准确高效的定性和定量检测，具有高特异性和高灵敏度，较之前的普通PCR检测研究提高了检测灵敏度达1－2个数量级，且能够进行定量检测和多重检测，突破了SYBRGREEN荧光染料法不能进行两重或多重检测的限制。该实时荧光PCR定性检测方法行准确高效，能够用于加强该病害防控检测和检疫工作。
【专利说明】检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种快速鉴定与定量检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其检测方法。
【背景技术】
[0002]由尖抱键刀菌I 号(Fusarium oxysporum f.sp.cubense racel, FOCl)和 4 号生理小种(F.0xysporum f.sp.cubense race4, F0C4)引起的香蕉镰刀菌枯萎病,是世界上香蕉的毁灭性病害，给世界的香蕉产业带来巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亚洲，年产量近一亿吨，是世界第二大水果作物，同时为近5亿人口的主要粮食之一，是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。日前共有120个国家和地区生产香蕉。近年来我国香蕉生产发展迅猛，居全球第二。香蕉业己成为我国热带地区农业的支柱产业。但是，随着香蕉种植面积逐年增加，香蕉病害的危害也日益严重，尤其是香蕉枯萎病给香蕉生产带来极大的威胁。1876年,Joseph Bancroft在澳大利亚首次报道了香蕉枯萎病。1904年在美国夏威夷也发现此病，1910年，巴拿马因香蕉枯萎病大发生，造成惨重损失，因而香蕉枯萎病又称为香蕉巴拿马病。同年，由Erwin F.Smith在古巴从香蕉病组织中分离到该病的病原菌，并将其命名为 Fusarium oxysporum f.cubenseE.F.Smith。1913 年 Ashby 对该病害及其病原菌首次做了详细的描述，Brandes于1919年首次确证了该病菌的致病性，1940年由 Snyder 和 Hansen 建议将该病菌正式命名为 F.0xysporum Schlecht.f.sp.cubense (E.F.Smith)Snyder et Hansen。{Moore, 1999#67}
[0003]目前，该病害已广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区。该病(I号小种)于1940—1950在中南美洲国家爆发感染，使风糜世界的国际贸易香蕉品种大蜜哈(Gros Michel)退出历史舞台。1967年我国台湾省发生香蕉枯萎病，20世纪70年代后流行，使台湾的香蕉面积从最高峰时期的50000公顷降至近年的5000公顷，而且其中的一半仍受到枯萎病的影响。菲律宾、澳大利亚、马来西亚、非洲等国家和地区的香蕉也相继局部发生枯萎病。
[0004]在中国于十九世纪五六十年代在广东、广西、海南发现该病侵染为害粉蕉，1996年广东番禹万顷沙镇的巴西及广东2号香蕉出现枯萎病，现已通过种苗和流水等传染途径扩散至中山、珠海、东莞、肇庆、信宜、高州和湛江(雷州半岛)等地，该病每年以30— 50公里速度传播，使许多蕉园不能种植香蕉，目前已有1000多公顷蕉园弃耕。现广东、广西(如南宁、百色)、福建(如漳州)、海南(如文昌、万宁、儋州、安定、澄迈)、云南(如河口、景洪)和台湾均有分布，对我国香蕉种植业构成严重威胁。
[0005]该菌因生理小种不同而危害不同品种的香蕉，世界上已报道有3个生理小种，其中I号小种世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品种大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan Latundan (AAB)和IC2 (AAAA)等香蕉品系；2号小种在中美洲洪都拉斯、萨尔瓦多、波多黎哥、多米尼加和维尔京群岛分布，仅感染杂种三倍体Bluggoe(ABB)及其近缘品种和某些Jamaica四倍体(AAAA)蕉；4号小种主要分布在澳大利亚、非洲以及菲律宾(卡拉雷群岛)等部分亚洲国家，可感染大蜜哈(AAA)、TaiwanLatundan (AAB)、PisangLilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品种及对其他小种有抗性的香牙蕉(AAA)，故危险性和毁灭性最大，引起世界各香蕉种植国家的高度关注。目前中国以小种4号和I号危害最为严重。
[0006]目前该病害没有好的防治措施，而且危害的区域在不断扩大，且对于粉蕉更存在复合侵染的现象。粉蕉经济价值高，且随着种植面积的增大，病害发生也日趋严重，对于粉蕉苗的检测和发病初期的早期检测而言，需要更为灵敏和准确有效的检测方法。对香蕉枯萎病及其病原的检测鉴定和监控防疫工作是解决香蕉枯萎病问题的前提和基础，检测方法的建立和应用对于阻止病害蔓延和发生具有重要的意义。
[0007]国内的检测鉴定研究，如王国芬等根据香蕉枯萎病菌ITS序列设计合成的三条引物:FusFl(5' AACCCCTGTGAACATACCACTTG3' )、FusRl(5' GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3')和 FusR2(5' GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3')构成引物对 A (FusFl/Rl)和 B (FusFl/R2)，对尖孢镰刀菌古巴专化型病菌进行了有效的PCR特异扩增试验。
[0008]对于生理小种检测鉴定方面主要集中在4号生理小种，如台湾Lin Yinghong等建立了针对F0C4特异性404bp序列的普通PCR检测引物，并应用SYBR GREEN荧光染料进行了实时荧光PCR检测。福建Li等建立了针对F0C4特异性404bp序列的LAMP方法检测4号生理小种。
[0009]近年来，有研究报道解决了两个生理小种的普通PCR鉴定问题。如刘景梅等尝试用RAPD技术区分生理小种，经过随机引物筛选出4个RAPD标记成功地转化为SCAR标记，其中Racel — SCAR标记I个、Race4 — SCAR标记2个、同时能鉴定出2个小种的SCAR标记I个。应用这4个SCAR标记同时对采自田间的9个病菌分离物进行检测，能够准确地鉴定出广东蕉区的尖孢镰刀菌古巴专化型Racel和Race4。2012年李敏慧等已建立了能够区分两个生理小种的普通PCR分子检测体系。但田间样品病菌含量低，干扰物质多，内生真菌、细菌和土壤中放线菌等分布广泛，对检测的灵敏度和特异性均构成了极大的干扰，造成现有检测方法往往因为灵敏度和特异性的限制而呈现检测结果不稳定的现象，对病害的早期检测带来了一个巨大的障碍。
[0010]实时荧光PCR技术是使用实时荧光扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。该方法较普通PCR方法更为灵敏可靠，较环介导等温扩增方法更稳定，不易污染，且可以实现多重检测，是现在通行灵敏并且可靠的检测方法，应用广泛。尤其是探针法实时荧光PCR技术因其特异性高、可多重检测，故常用于SNP解析，病毒、病原菌检测。但目前尚未有探针法实时荧光PCR检测尖孢镰刀菌的报道，更缺乏专门针对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的实时荧光PCR检测方法。
[0011]本方法建立了能够准确高效区分尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。希望能够通过该方法的建立，解决含量低、干扰多的难题；同时，建立了一种能够定量检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的方法以应用于菌含量的对比研究。
[0012]本方法能用于同时实时荧光PCR法检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，且更稳定，灵敏度较高，符合“快、准、稳、省”的检测一般要求。相对于其他更灵敏的方法如LAMP方法更为稳定，不易污染，相对传统PCR方法和接种鉴定生理小种方法更为灵敏和快速，可以在幼苗期进行检测，对于香蕉生产上意义重大。因为香蕉属于三倍体作物，不能通过传统的杂交育种来繁殖，生产上采用组培苗来做田间种植，所以对于田间香蕉枯萎病的控制主要在种苗的监测上，而种苗中的含菌量是很低的，需要灵敏度较高的检测方法，而本研究建立的方法能够较好地解决这一问题，应用前途广泛。而且，由于F0C4在中国境内危害日益严重，田间调查发现F0C4的危害有进一步扩大的趋势。本方法首次针对F0C4建立了 TaqMan探针实时荧光检测方法，同时可用于配合其它生理小种TaqMan荧光检测引物进行双重或多重荧光PCR定量检测尖镰孢属古巴专化型的菌含量(拷贝数)。对于监控和防止该生理小种的进一步蔓延有重大意义。
[0013]本方法基于该病原的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的特异保守引物和TaqMan探针建立了一种实时荧光PCR定性检测方法，能够在1.5小时内同时分别对尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种进行准确高效的定性和定量检测，具有高特异性和高灵敏度，较之前的普通PCR检测研究提高了检测灵敏度达I 一 2个数量级，且能够进行定量检测和多重检测，突破了 SYBRGREEN荧光染料法不能进行两重或多重检测的限制。该实时荧光PCR定性检测方法行准确高效，能够用于加强该病害防控检测和检疫工作。

【发明内容】

[0014]本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种快速准确灵敏的检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针引物及其检测方法。
[0015]本发明的另一目的在于提供所述检测方法的应用。
[0016]本发明是采用以下方案实现的:一种快速检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的TaqMan探针检测方法，包含以下步骤:
[0017]1.引物和探针
[0018]引物采用PrimerExpress3.0软件设计，由大连TAKARA公司合成。
[0019]F0C4所用弓丨物和探针如下:
[0020]Foc4-0422F25’ GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3 ’
[0021]Foc4-0422R25’ TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3 ’
[0022]Foc4-0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQ 13J
[0023]2.DNA提取和浓度测量
[0024]样品DNA提取采用CTAB两步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDroplOOO型核酸微量测定仪测定核酸浓度。具体提取步骤如下:
[0025]称取Ig样品(根据样品的DNA含量，可以调整样品量)，加入到50mL的离心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；65°C过夜后，8000r/min室温离心IOmin,取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000 X g离心lOmin，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 Xg离心lOmin，弃去上清，加入350 μ LNaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000 Xg离心lOmin，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸,室温放置20min, 13000 X g离心IOmin,弃去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中。[0026]3.实时荧光PCR检测方法特异性验证
[0027]使用荧光探针Foc4-0422P2及引物Foc4-0422F2/Foc4_0422R2进行实时荧光PCR，共同检测香蕉串珠镰刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龙果枯萎病菌等镰刀菌属内近似种及镰刀菌属外青霉属。扩增试剂盒采用ABI试剂盒2XTaqManUniversal PCR Master Mix II。
[0028]实时荧光PCR反应体系如下:
[0029]
【权利要求】
1.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种iFusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)的TaqMan引物和探针,其中，所述的引物序列为:上游引物Foc4_0422F25，GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3，，下游引物 Foc4_0422R2 5，TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3，，探针序列为5’荧光标记，3’淬灭剂标记的DNA序列，所述的序列为:Foc4-0422P25’ Dye-ATAATCGAACAGTTTGCG-Quen 3’。
2.根据权利要求1所述的探针，其中所述的突光剂选自Biotin、Cy3、Cy5、Digoxin、FAM、HEX、JOE、ROX, TAMRA, Amino、Phosphorylation、ROX, SHC6、SIMA(HEX)、TET。
3.根据权利要求1所述的探针，其中所述的淬灭剂选自JOE、BHQl、BHQ2、ROX、BHQ3、TAMRA> Biotin、BiotinTEG、Dabcyl> Dabsyl> TET、Digoxin、Amino、diThiol、Eclipse、FAM、HEX、Phosphorylation, SHC6、SHC3。
4.如权利要求1所述的引物和探针，其中所述的探针的为Foc4-0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQI 3’。
5.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种iFusarium oxysporumf.sp.cubense race 4)的试剂盒，其特征在于包括引物和探针，所述的引物和探针的序列为:上游引物 Foc4-0422F2 5’ GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3 ’，下游引物 Foc4-0422R2 5 ’ TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3’，探针序列为:Foc4_0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQI 3’。
6.如权利要求5所述的检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的试剂盒，其特征在于还包括实施荧光定量PCR所需要的其他试剂，具体为TaqMan Universal PCR MasterMix，包含尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种DNA片段的质粒模板，TE缓冲液。
7.—种检测尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的探针和引物进行TaqMan荧光定量检测，具体方法包括: 1)样品DNA提取采用CTAB两步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDroplOOO型核酸微量测定仪测定核酸浓度。具体提取步骤如下: 称取Ig样品(根据样品的DNA含量，可以调整样品量)，加入到50mL的离心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；65°C过夜后，8000r/min室温离心IOmin,取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000Xg离心lOmin，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 Xg离心lOmin，弃去上清，加入350 μ LNaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000 Xg离心lOmin，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸,室温放置20min, 13000 X g离心IOmin,弃去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中； 2)实时荧光PCR检测方法特异性验证 使用荧光探针Foc4-0422P2及引物Foc4-0422F2/Foc4_0422R2进行实时荧光PCR，共同检测香蕉串珠镰刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龙果枯萎病菌等镰刀菌属内近似种及镰刀菌属外青霉属。扩增试剂盒采用ABI试剂盒2XTaqMan UniversalPCR Master Mix II， 实时荧光PCR反应体系如下:
【文档编号】C12N15/11GK103789417SQ201410011302
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】杨雷亮, 孙丽霞, 邱德义, 陈定虎, 李华平, 管维, 王章根 申请人:中华人民共和国中山出入境检验检疫局