蜡状芽孢杆菌zjb-11071及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ZJB-11071及其在生物催化合成环氧氯丙烷及手性药物中间体中的应用，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2013314，保藏日期2013年7月5日；蜡状芽孢杆菌ZJB-11071对1,3-二氯-2-丙醇转化率达到42.3％，对2,3-二氯-2-丙醇转化率达到21.1％，对1,3-二溴-2-丙醇转化率达到95％，对S(-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯转化率达到24.6％。
CCTCC No：M 2013314
2013.07.05
【专利说明】蜡状芽孢杆菌ZJB-11071及其应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产脱卤酶的菌株-錯状芽孢杆菌（Bacillus cereus) ZJB-11071，及其在生物催化合成环氧化物和手性药物中间体中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 1948年Η印pel等首先描述了由微生物产生的能使二氯甲烷水解成甲醛的脱卤 酶，此后不同类型的脱卤酶被相继发现。I960年Janssen把能从卤族有机化合物上使卤 族离子释放出来的酶统称作脱卤酶（Dehalogenase)。从1968年Castro等首次发现以 2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌$13￥(^3丨61'；[111]18口.）菌株至今，人们相继 筛选到多种可以降解卤代醇的微生物。其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌 (Agrobacterium radiobacter)ADl和节杆菌（Arthrobacter sp.)AD2 以及从土壤中获得的 棒状杆菌（Corynebacterium sp. )N-1074等。虽然它们降解有机齒化物的途径虽然存在明 显差异，但是卤代醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。 (三）
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种能够产生卤醇脱卤酶的菌株一一蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) ZJB-11071，及其在生物催化合成环氧化物和手性药物中间体中的应 用。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址：中国.武汉.武汉大学，430072,保藏编号CCTCC N〇:M2013314,保藏日期2013年7 月5日。该菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得，经检测具有催化合成 环氧化物和手性药物中间体（R(-)4-氰基-3-羟基丁酸乙酯）的性能。
[0006] 本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在微生物催化卤代醇制备环氧化 物中的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化剂， 以卤代醇为底物，于pH值为7. 0?7. 5的缓冲液中，在35°C、150rpm条件下进行转化反应， 转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相即为含有环氧化物的 混合液，将混合液分离纯化，获得所述环氧化物。
[0007] 所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为30?80g/L，优选50g/L，所述底物 的初始浓度为20?50mmol/L。
[0008] 所述卤代醇为1，3-二氯-2-丙醇、2, 3-二氯-2-丙醇或1，3-二溴-2-丙醇。
[0009] 本发明还涉及所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在生物催化合成手性药物中间体 中的应用，所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催化剂，以 S (_)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，于pH值为7. 0?7. 5的缓冲液中，在35°C下进行转 化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，将混合液分 离纯化，获得R(_) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度 为50g/L，所述底物的初始浓度为20?50mmol/L。
[0010] 本发明所述湿菌体按如下方法制备：
[0011] (1)斜面培养
[0012] 将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30°C培养12h，获得斜面菌体；
[0013] 所述斜面培养基终浓度组成为：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，琼 脂20. Og/L，溶剂为水，pH值为7. 0 ;
[0014] ⑵种子培养
[0015] 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C培养24h，获得种子液； 所述种子培养基终浓度组成为：NaCllO. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，溶剂为水， pH值为7.0 ;
[0016] ⑶发酵培养
[0017] 将种子液以体积浓度1%的接种量接种至发酵培养基中，30°C，150rpm振荡培养 60h后，在12000g下离心5min，收集湿菌体；
[0018] 所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP0 43. 2g/ L, K2HP041. 5g/L, Na2EDTA0. 06g/L, MnS040. 002g/L, MgS040. OOlg/L, ZnS040. 002g/L, FeS040 . 01g/L，溶剂为水，pH 值为 6. 8。
[0019] 通常的，保存的菌株从冰箱中取出后进行下一步操作前，需要进行活化培养，按照 常规方法即可，通常选择LB培养基进行斜面培养，培养温度30°C，培养时间2天。
[0020] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株新菌株一蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)ZJB-l 1071，及其在生物催化环氧化物和手性药物中间体中的应用，錯 状芽孢杆菌ZJB-11071对1，3-二氯-2-丙醇转化率达到42. 3%，对2, 3-二氯-2-丙醇转 化率达到21. 1 %，对1，3-二溴-2-丙醇转化率达到95%，对S (-) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯 转化率达到24. 6 %，具有重要应用前景。 (四）
【专利附图】
【附图说明】：
[0021] 图1为1，3-DCP和ECH的气相色谱图。 (五）
【具体实施方式】：
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 实施例1 :錯状芽孢杆菌ZJB-11071的筛选
[0024] 本发明从全国各地取土样，共取土样80份。筛选的具体方法：称取lg 土样置于 50mL富集培养基中，于30°C，150r/min振荡培养2-3天。取lmL富集液加入50mL新鲜富集 培养基中，如此重复3次后进行分离纯化。
[0025] 选用溴百里香酚蓝作为指示剂检测能够降解底物的菌落。其原理为：含氯有机物 降解的同时会释放质子，从而使培养基局部的pH值发生改变。指示剂溴百里香酚蓝变色范 围为5. 8-7. 6 (黄-蓝），因此能利用含氯有机物的菌落周围呈现黄色，而不能利用的则菌落 周围平板颜色仍为青绿色。
[0026] 将富集液用无菌水逐级稀释10个梯度，选取10' 10' 10' 10' 1(Γ1(Ι五个梯度的 稀释液各取0. lmL均匀涂布在平板筛选培养基上，30°C恒温培养48h。挑取指示平板上黄色 单菌落接种到斜面培养基上，放入30°C的恒温培养箱中培养,长至菌落直径大小为3-4mm 左右时，于4 C保减。
[0027] 将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30°C培养24h。将种子液以体 积浓度1%的接种量接种至发酵培养基中，30°C，150rpm振荡培养60h。在12000g下离心 5min，收集湿菌体，加入一定体积的磷酸缓冲液（50mM，pH7. 0)制成0. 5g/mL菌悬液用于转 化。转化条件如下：磷酸盐缓冲液（50mM，pH7. 0) 10ml中加入0. 5g/mL菌悬液（菌悬液的用 量以湿菌体质量计为50g/L反应体系）10ml，1，3-DCPO. 03mol (终浓度30mM)，置于30°C水 浴摇床转化24h，取lmL转化液，乙酸乙酯萃取后气相检测分析。最终得到一株催化活力较 高的野生菌株，并将此菌株命名为菌株ZJB-11071。
[0028] 气相分析条件为：采用的气相色谱仪为美国安捷伦Agilent-7890型，配备FID检 测器。色谱分析条件：色谱柱为HP-5毛细管柱；柱温为80°C保持4minlO°C /min升温至 l〇〇°C ;前进样口温度为230°C ;检测器FID温度为250°C ;载气（N2)流速为54. OmL/min。在 该条件下，标样出峰情况如图1所示，1，3-DCP和ECH的出峰时间分别为5. lmin和3. 7min。
[0029] 所述富集培养基终浓度组成为（g/L) :Na2HP045. 37, ΚΗ2Ρ041· 36,（NH4)2S041. 25， Na2EDTA0. 06, MnS040 . 00 2, MgS040 . 001，ZnS040. 002, FeS040. 01，溶剂为水，pH 值为 6· 8。
[0030] 所述平板筛选培养基为（g/L) :Κ2ΗΡ045· 37,（NH4)2S041. 25, ΚΗ2Ρ041· 36,酵母抽提 物0.2,琼脂20,溶剂为水，pH值为6.8。121°C20min灭菌。冷却至50-60°C时加入溴百里 香酚蓝0. 06g，1，3-DCP2mL，利用NaOH调至青绿色后倒平板。
[0031] 所述斜面培养基终浓度组成为（g/L) :NaC110.0,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,琼脂 20. 0,溶剂为水，pH值为7.0。
[0032] 所述发酵培养基终浓度组成为（g/L):乳糖8,蛋白胨6, Na2HP043. 2, K2HP041. 5， Na2EDTA0. 06, MnS040 . 00 2, MgS040 . 001，ZnS040. 002, FeS040. 01，溶剂为水，pH 值为 6· 8。
[0033] 实施例2 :菌株ZJB-11071的鉴定
[0034] 本发明实施例1筛选得到的菌株ZJB-11071在斜面培养基上，37°C培养24小时 后形成圆形或近圆形，质地软，表面较粗糙，扁平，边缘不规则，有光泽的乳白色菌落，直径 5-7_。革兰氏染色观察：紫色短杆状。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，孢囊无明 显膨大。
[0035] 通过Biolog(GENIII)自动微生物检定系统对菌株ZJB-11071进行了 94种表型 测试，包括71种碳源利用情况以及23种化学敏感性检测。经Biolog读数仪分析菌株的 代谢指纹，结果表明菌株ZJB-11071能与22种化学物质发生灵敏反应，对40种碳源的利 用率较大，而对其他31种的碳源的利用较低或者完全不能利用。Biolog系统给出36h鉴 定结果，如表1和表2所示，确定菌株ZJB-11071为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus)。 同时以菌株ZJB-11071的总DNA为模板，利用引物：P1:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 P2:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后， 委托上海生工对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上 用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对。基于形态、 生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，最终确定该菌为蜡状芽孢 杆菌，命名为錯状芽抱杆菌（Bacillus cereus)ZJB-11071。
[0036] 表1菌株对Biolog GEN III板上71种碳源的利用能力
[0037] TablelUtilization of71carbon-substrates by the strain using Biolog GEN III microplate
[0038]
【权利要求】
1. 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中国典型培养物保藏中心，地 址：中国?武汉?武汉大学，430072,保藏编号CCTCC No :M2013314,保藏日期2013年7月 5曰。
2. 如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在生物催化卤代醇生成环氧化物中 的应用，其特征在于所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为 催化剂，以卤代醇为底物，于pH值为7. 0?7. 5的缓冲液中，在35°C下进行转化反应，转化 反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相即为含有环氧化物的混合 液，将混合液分离纯化，获得所述环氧化物。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度 为30?80g/L，所述底物的初始浓度为20?50mmol/L。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述卤代醇为1，3-二氯-2-丙醇、2, 3-二 氯-2-丙醇或1，3-二溴-2-丙醇。
5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备： (1) 斜面培养 将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30°C培养12h，获得斜面菌体； 所述斜面培养基终浓度组成为：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，琼脂 20. 0g/L，溶剂为水，pH值为7. 0 ; (2) 种子培养 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C培养24h，获得种子液；所述 种子培养基终浓度组成为：NaC110.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶剂为水，pH值 为 7.0 ; (3) 发酵培养 将种子液以体积浓度1 %的接种量接种至发酵培养基中，30°C，150rpm振荡培养60h 后，在12000g下离心5min，收集湿菌体； 所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP043. 2g/L，K2HP04l. 5g/L， Na2EDTA0. 06g/L，MnS040. 002g/L，MgS040. 001g/L，ZnS040. 002g/L，FeS040 . 01g/L，溶剂为水， pH值为6.8。
6. 如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-11071在生物催化合成手性药物中间体中的 应用，其特征在于所述的应用为：以蜡状芽孢杆菌ZJB-11071经发酵培养后的湿菌体为催 化剂，以S (-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，于pH值为7. 0?7. 5的缓冲液中，在35°C下 进行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液用乙酸乙酯萃取，离心，取上层有机相，将混 合液分离纯化，获得R(_) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度 为30?80g/L，所述底物的初始浓度为20?50mmol/L。
8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备： (1)斜面培养 将蜡状芽孢杆菌ZJB-11071接种至斜面培养基，在30°C培养12h，获得斜面菌体； 所述斜面培养基终浓度组成为：NaCllO. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，琼脂 20. 0g/L，溶剂为水，pH值为7. 0 ; (2) 种子培养 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30°C培养24h，获得种子液；所述 种子培养基终浓度组成为：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，溶剂为水，pH值 为 7.0 ; (3) 发酵培养 将种子液以体积浓度1 %的接种量接种至发酵培养基中，30°C，150rpm振荡培养60h 后，在12000g下离心5min，收集湿菌体； 所述发酵培养基终浓度组成为：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP043. 2g/L，K2HP04l. 5g/L， Na2EDTA0. 06g/L，MnS040. 002g/L，MgS040. 001g/L，ZnS040. 002g/L，FeS040 . 01g/L，溶剂为水， pH值为6.8。
【文档编号】C12N1/20GK104232508SQ201410359149
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】柳志强, 郑裕国, 高爱存, 薛亚平, 薛峰, 万南微 申请人:浙江工业大学